三峡库区重庆万州段鼻息肉与HPV及EBV阳性表达的相关性研究*

谭学君姚文昊陈晓平伍立德吴敌文溢温晓霞朱娟娟

三峡库区重庆万州段鼻息肉与HPV及EBV阳性表达的相关性研究*

谭学君1姚文昊2陈晓平3伍立德1吴敌1文溢1温晓霞1朱娟娟4

目的探讨三峡库区重庆万州段人群鼻息肉与HPV和EBV阳性表达的关系。方法取三峡库区重庆万州段190例鼻息肉石蜡包埋组织标本，采用核酸分子快速导流杂交基因芯片分型技术（HybriMax）和实时荧光定量PCR技术检测HPV和EBV DNA，并以36例健康志愿者鼻腔黏膜组织作为正常对照。结果鼻息肉石蜡标本HPV DNA总阳性表达率0%（0/190），EBV DNA总阳性表达率为63.16%（120/190，P＜0.05），对照组中HPV和EBV DNA均为阴性（0/36）。结论在三峡库区重庆万州段人群中，鼻息肉的发病与EBV感染密切相关，这对鼻息肉的临床诊治、防止复发以及相关疫苗的研发有一定意义。

鼻息肉；EBV感染；病理意义

鼻息肉（nasal polyps）是以极度水肿的鼻黏膜在中鼻道形成单发或多发息肉为临床特征的常见疾病群，发病率占总人口的1%～4%[1]，其发病率及复发率均较高。较被公认的发生、发展及复发原因是感染性因素[2]和过敏因素[3]，其中感染性因素被认为是其主要因素。由于过去科技水平的限制，大多数研究人员只把目光放在细菌感染的相关性研究上。然而临床上有相当一部分（约30%）鼻息肉患者虽经过长期激素、抗生素及多次手术治疗仍不可避免复发（又被称为难治性鼻息肉鼻窦炎），其发生原因尚不明确，成为临床治疗的难点。自1956年，国外学者Weille和Bohd将鼻息肉混悬液移种到鸡胚中，结果观察到尿囊液中的蛋白质增加，首先提出鼻息肉可能系病毒感染所致[4]。近年来，随着病毒分子生物学和免疫组化等新科技的发展，病毒DNA的检测成为可能，病毒致病理论不断完善，因而病毒感染对鼻息肉的发生、发展，尤其是HPV和EBV对鼻息肉的复发有无特异性的作用等问题引起了人们的关注。众多学者的研究表明在鼻腔鼻窦息肉病变中，HPV和EBV均有不同程度的阳性表达，如董晶等[5]对70例鼻息肉标本进行HPV-DNA-Typing方法进行检测得出HPV感染阳性率为27.14%，张学云等[6]对26例鼻息肉标本进行HPV-DNA检测得出HPV阳性标本19例（73.4%）。而人类普遍感染Epstain-Barr病毒（EBV），人群感染率达90%[7-9]。Tao等[10]分别从基因水平和蛋白质水平研究，发现80%鼻息肉组织有EBV潜伏感染，其受染细胞为T/B淋巴细胞，提示EBV的感染可能构成了鼻息肉形成的背景环境。在我们的前期研究中，对上海地区102例鼻内翻性乳头状瘤（NIP）石蜡包埋组织标本[11-13]和204例鼻息肉石蜡包埋组织标本[14-16]进行了37种HPV亚型同步进行检测和病毒分型，初步确认了HPV在NIP、鼻息肉病变中的高表达。现本研究采用核酸分子快速导流杂交基因芯片分型技术（HybriMax）和实时荧光定量PCR技术对三峡库区重庆万州段190例鼻息肉石蜡包埋标本组织进行HPV和EBV检测，旨在探讨三峡库区重庆万州段鼻息肉的发生发展与HPV及EBV感染的关系。

资料与方法

1 临床资料

本研究中190例鼻息肉石蜡包埋组织标本来源于重庆市万州区上海医院2009～2013年经病理确诊并有完整临床资料的鼻息肉患者。其中男性141例，女性49例；年龄9～76岁，平均42.02岁。病程2个月～30年，平均2.04年，1月～1年119例，1～5年58例，5年以上13例。190病例中，1次手术为179例,2次手术及以上为11例。36例正常鼻甲黏膜组织为对照，其中男性22例，女性14例，年龄18～67岁，平均45.75岁，志愿者均签知情同意书。

2 研究方法

2.1 试剂和主要仪器

导流杂交所用HybriMax核酸分子快速杂交仪、QIAGEN Blood Mini Kit（DNA提取）试剂盒、QIAGEN Blood Mini Kit（DNA提取）试剂盒、聚合酶链反应（PCR）试剂盒、Epstein-Barr病毒核酸检测试剂盒（荧光PCR法）、HPV核酸扩增分型检测试剂盒（国药准字：S20060011）均购自凯普生物化学有限公司。Verti96-well Thermal Cycler PCR扩增仪、7500 Real Time PCR System荧光PCR仪（Applied Biosystems）为美国Applied Biosystems公司生产。

2.2 方法

2.2.1 7型HPV检测：①样本DNA提取：采用液氮研磨后，按照试剂盒说明书提取标本中的DNA；②PCR扩增：按照样本数量,分别取PCRpremix、Taq酶23.25μL、0.75μL混匀,按照样本编号取1μL提取的DNA加入到PCR混合液中,总反应体积为25μL。按照预先设置好的PCR反应程序进行PCR扩增，同时以蒸馏水为阴性对照,进行40个循环。③导流杂交：在导流杂交仪中放入标记有HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、CP8304共21种寡核苷酸探针的低密度基因芯片,按试剂盒说明进行导流杂交,酶标显色。④结果判断：根据芯片上HPV分型分布相应的阳性点判断HPV亚型，确定相应组织中HPV亚型的分布情况。（肉眼观察检测结果,阳性点呈现蓝紫色圆点,根据芯片上不同HPV基因型分布相应的圆点来判断HPV有无感染及判定亚型。

2.2.2 EBV检测：①样本DNA提取：采用液氮研磨后，按照试剂盒说明书提取标本中的DNA；②PCR扩增（按PCR扩增试剂盒说明书进行操作）：从GenBank中查出EBV的可针对序列，并设计扩增EB病毒DNA段的引物序列。取已标注上PCR Masermix的1.5mlEP管，将PCR试剂中的PCR premix、DNATaq酶按下表中每个反应所需PCR组份量准备PCR Mastermix。设置阴性对照管（蒸馏水）和阳性对照管，充分混匀配制好的扩增试剂，8,000转/分钟10s，向已设定的146个PCR反应管内分别加入18μl已配好的扩增试剂，加样后放入相应的荧光PCR检测仪内检测。④结果判断：样本的Ct值显示为Undet。样本的Ct值≤40，判断为阳性；若为40＜Ct值＜45的样本建议重做，重做结果Ct值＜40者为阳性，否则为阴性。

3 统计学分析

数据输入SPSS 19.0软件，采用卡方检验对实验结果进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 鼻息肉组与健康对照组HPV阳性表达的情况

190例鼻息肉石蜡包埋组织标本中HPV总的阳性表达率为0%，36例健康对照组鼻黏膜组织标本中HPV均为阴性，两组之间HPV阳性表达率差异无统计学意义。

2 鼻息肉组与健康对照组EBV阳性表达的情况

2.1 190例鼻息肉石蜡包埋组织标本中EBV阳性表达120例，总检出阳性率为63.16%（120/190）。36例健康对照组鼻黏膜组织标本均为阴性。两组之间的差异有统计学意义（见表1，χ2=48.48，P=0.000＜0.05），结果显示鼻息肉组中EBV阳性表达率明显高于对照组。

表1 EBV在鼻息肉组及对照组的表达（例）

2.2 本研究鼻息肉组190例标本中男性标本为141例，其中EBV阳性的为87例，占61.70%；女性标本为49例，其中EBV阳性者为33例，占67.35%；两组之间无统计学差异（见表2，χ2=0.498，P=0.480＞0.05）。表明鼻息肉患者性别与EBV感染无明显相关性。

表2 鼻息肉组性别与EBV感染的关系（例）

2.3 本研究对鼻息肉组按照年龄大小，分为9～19岁组15例、20～29岁组33例、30～39岁组36例、40～49岁组48例、50～59岁组30例、60～69岁组19例、70～79岁组9例。可以看出年龄与EBV感染之间无明显统计学差异（见表3，x2=8.998，P=0.174＞0.05）。表明鼻息肉患者年龄与EBV感染之间无明显相关性。

表3 鼻息肉组年龄与EBV感染的关系（例）

2.4 本研究鼻息肉患者中病程小于1年（包括1年）的为119例，其中EBV阳性病例有75例；1～5年（包括5年）的为58例，EBV阳性有34例；大于5年的为13例，EBV阳性为11例。病程长短与EBV感染的关系经统计学分析无统计学意义（见表4，χ2=3.086，P=0.214＞0.05）。表明鼻息肉患者病程与EBV感染无明显相关性。

表4 鼻息肉组中病程与EBV感染的关系（例）

2.5 本研究鼻息肉患者中首次手术为179例，其中EBV阳性的为114例，占63.69%；手术2次及以上标本为11例，其中EBV阳性为6例，占54.55%。两组之间无统计学差异（见表5，χ2=0.372，P=0.542＞0.05）。表明手术次数与EBV感染无明显相关性。

表5 鼻息肉标本手术次数与EBV感染的关系（例）

讨论

1 鼻息肉与HPV感染的关系

鼻息肉与HPV关系的研究国内外时有报道，但在前人的报道中病例数量相对较少，且检测方法不一，故检出率为0%-92.3%不等[17-20]。本研究采用HybriMax法是在核酸分子杂交仪进行杂交，酶标显色后进行结果判定。分子杂交提高了反应的特异性,同时又可以检测常见的37种HPV亚型,并能准确进行HPV基因分型，研究方法的灵敏度高、特异性强、检测范围广，弥补了其他检测方法的不足。陶萍萍等[20]对HybriMax法和第二代杂交捕获法比较发现，第二代杂交捕获法与HybriMax法检测结果的一致性良好。Olmos等[21]报道表明HybriMax法灵敏度较PCR法高，杂交速度快，结果准确。

既往研究中，我们对上海地区204例鼻息肉石蜡包埋组织标本采用采用此方法检测出HPV检测总的阳性表达率为40.2%（82/204），对照组标本检测均为阴性[16]，故我们提出了鼻息肉病变的发生与HPV感染有较密切的相关性的结论。但在本次研究中，我们对重庆市万州区三峡库区段190例鼻息肉石蜡包埋组织标本采用相同方法检测出HPV总的阳性表达率为0%，结果提示鼻息肉的发生与HPV感染无明显相关性，这一结果的差异可能是由于HPV感染具有地区性的差异，其中不排除外界环境因素对其感染的影响，具体造成两地HPV感染差异性因素有待在日后研究中进一步探索与比较。

2 鼻息肉与EBV感染的关系

鼻息肉的发病与炎症反应、细胞因子，免疫应答、变态反应、基因表达改变以及环境因素等均有密切相关[22]。近年来，EBV可引起鼻咽癌的发生已被公认，各种研究表明EBV在鼻腔、口咽、鼻咽部病变的发病过程中均扮演着非常重要的角色。而EBV感染与鼻内翻性乳头状瘤、鼻息肉、扁桃体和腺样体肥大等常见疾病的发生发展是否有相关性及其作用机制尚不十分确定[23-26]。王卫华[27]等对慢性鼻-鼻窦炎的发病机制的研究观点认为，鼻腔和(或)鼻窦的病毒感染可使黏膜上皮的屏障作用受损，为窦腔的再次细菌感染奠定了基础。董龙宝等[28]的研究认为EBV的感染使潜伏膜蛋白LMPl被激活,可上调表皮生长因子受体(EGFR)、干扰素、调节因子2和CD23等的表达，下调CDl0的表达，激活细胞黏附分子LFAl等，进而促进核诱导B细胞的增殖，并通过上调C-erbB-2基因的表达,产生大量的生长因子，对细胞的生长、增殖及分化起到干扰与破坏作用。前人对鼻息肉的发生与EBV感染的关系的研究相对较少，且报道中病例数量较少。本次研究对190例鼻息肉病理标本采用实时荧光定量PCR技术测定EBV阳性表达率，样本量大，检测方法先进，结果更为可靠。190例鼻息肉病理标本中EBV总的阳性率为63.16%（120/190），对照组标本均为阴性，两组差异有统计学意义(P＜0.05)，结果显示鼻息肉中EBV的阳性表达率明显高于正常鼻腔黏膜标本，与前人的研究结果一致[28-29]，表明鼻息肉的发生与EBV感染密切相关。通过对190例鼻息肉标本的分组研究，我们研究发现患者的性别、年龄、病程长短、手术次数与EBV感染无明显相关性，但随着患者的年龄增长，EBV的感染率有增高的趋势。

1 Bateman ND,Fahy C,Woolford TJ.Nasal polyps:still more questions than answers[J].Journal of Laryngology and O－tology,2003.117：1-9.

2 Niels M，Ronald D，Claus B.Nasal polyposis，eosinophil dominated inflammation,and allergy[J].Thorax，2000，55 (2):79-83.

3 Emanuel IA,Shah SB,Chronic rhinosinusitis:allergy and sinus computed tomography relationships[J].Otolaryngol Head Neck Srug,2000,123(6):687-691.

4 王轶鹏,董震.鼻息肉病的病理机制研究进展.中华耳鼻咽喉科杂志,1999,34(3):181-183.

5 董晶,徐永昌,王欣波,等.人类乳头状瘤病毒与鼻息肉的关系[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志,2003,4:34-36.

6 张学云,刘振卿,单伯仪,等.鼻息肉组织中HPV-DNA检测及其意义[J].临床耳鼻咽喉科杂志,1997,3:136.

7 Newton JR,Ah-See KW.A review of nasal polyposis. Ther Clin Risk Manag,2008,4(2):507-512.

8 Zaravinos A,Bizakis J,Spandidos DA.Prevalence of human papilloma virus and human herpes virus types 1-7 in human nasal polyposis.J Med Virol,2009,81（9）:1613-1619.

9 Dutsch-Wicherek M,Tomaszewska R,Lazar A,et al.The evaluation of metallothionein expression in nasal polyps with respect to immune cell presence and activity.BMC Immunol.2010,11:10.

10 Tao Q,Srivastava G,Dickens P,et al.Detection of Epstein-Barr virus-infected mucosal lymphocytes in nasal polyps.Am J Pathol,1996,149(4):1111-1118.

11 孙璞,陈晓平,裴斐,等.鼻内翻性乳头状瘤与人乳头状瘤病毒感染及其亚型的关系.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志,2010,45（4）:310-313.

.12孙璞,张燚,马瑞霞,等.鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤临床分期与人乳头状瘤病毒感染的关系.中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志,2011,19(2):125-127,132.

13孙璞,陈晓平.鼻内翻性乳头状瘤与人乳头状瘤病毒相关性.国际耳鼻咽喉头颈外科杂志，2010，35（2）：112-114.

14 Fei Pei,Xiao-Ping Chen,Yi Zhang,et al.Human papillomavirus infection in nasal polyps in a Chinese population.Journal of General Virology，2011,92（8）: 1795-1799.

15 裴斐，陈晓平.鼻息肉与人乳头状瘤病毒感染的相关性.国际耳鼻咽喉头颈外科杂志，2010,34（6）：356-358.

16 张燚,裴斐,伍立德,等.人乳头状瘤病毒在鼻息肉组织中的阳性表达及其意义.中国耳鼻咽喉头颈外科杂志，2014，21（2）：81-84.

17 Becker M,Forslund O,Hansson BG,et al.H for the human papillomavirus in nasal polyps,using a polymerase chain reaction-method[J].Otolaryngol,1994,23:344-346.

18 Hoffmann M,Klose N,Gottschlich S,et al.Detection of human papillomavirus DNA in benign and malignant sinonasal neoplasms[J].Cancer Lett,2006,239:64-70.

19 周玉英,胡牧,刘翠苓.息肉病中人类乳头状瘤病毒-DNA检测[J].临床耳鼻咽喉科杂志,2001,15(5):212-213.

20 陶萍萍,卞美璐,欧华,等.导流杂交基因芯片技术在人乳头状瘤病毒检测中应用的研究.中华妇产科杂志, 2006,41(1),43-47.

21 Olmos A,Bertolini E,Cambra M.Isothermal amplification coupledwithrapidflow-throughhybridisationfor sensitive of Plum pox virus.J Virol Methods,2007,139 (1):111-115.

22 岳丽艳,郑永波,赵宇.鼻息肉发病机制研究进展.国际耳鼻咽喉头颈外科杂志,2012,36(3):157-162.

23 Gulley M L.Molecular diagnosis of Epstein-Barr virusrelated diseases.Mol Diagn,2001，3:1-10.

24 Xiao-cheng Xue,Xiao-ping Chen,Wen-hao Yao,et al. Prevalence of Human Papillomavirus and Epstein–Barr Virus DNA in Chinese Children with Tonsillar and/or Adenoidal Hypertrophy.Journal of Medical Virology 2014, 86（6）：963-967.

25 张晓彤,李洪跃,刘雪梅,等.EB病毒在儿童腺样体肥大和扁桃体炎组织内的定量研究及意义.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2009,23(24):1108-1111.

26 孙健,鞠建宝,王世端.青岛地区扁桃体腺样体肥大儿童EB病毒及人巨细胞病毒的检测.青岛大学硕士论文, 2010，24(12):14-18.

27 王卫华.鼻窦炎的微牛物学[A].北京:中国医药科技出版社,2006:77.

28 董龙宝，李刚强，徐林跟，等.EB病毒、P53及Ki67在鼻息肉组织中的表达及意义.中国临床医学，2010,17（3）：429-431.

29 黎庆梅,陈辉,庄碧英.实时荧光定量PCR在EB病毒DNA检测中的应用.国际检验医学杂志，2011,32(13): 1423-1424.

(收稿:2014-10-15修回：2014-10-30)

Association of HPV and EBV infection in the tissue of nasal polyps in the population of Wanzhou section of Chongqing in the Three Gorges Reservoir

TAN Xuejun,YAO Wenhao,CHEN Xiaoping,WU Lide,WU Di,WEN Yi,WEN Xiaoxia,ZHU Juanjuan
Ningxia Medical University,Yinchuan,404020,China

ObjectiveTo investigate the association of HPV and EBV infection in the tissue of nasal polyps in the population of Wanzhou section of Chongqing in the Three Gorges Reservoir.MethodsIncluded in this study were 190 paraffin embedded tissue samples of nasal polyps,with HPV DNA and EBV DNA detected by HybriMax procedure and Real-time PCR technique to determine their positive rates and to explore the possible pathological implications of HPV and EBV infection in this lesion in the population of Wanzhou section of Chongqing in the Three Gorges Reservoir.Meanwhile,normal nasal mucous samples were taken from 36 healthy volunteers as control.ResultsHPV DNA was positive in none in this group of cases,while the positive rate of EBV DNA was 63.1% (120/190,P＜0.05).None of control samples was positive either for HPV or EBV.ConclusionsIt is shown from this study that EBV infection may play a role in the development of nasal polyps in the population of Wanzhou section of Chongqing in the Three Gorges Reservoir.This may suggest its possible implications in diagnosis and treatment of the condition,prevent it from reoccurring postoperatively,and vaccine development against nasal polyps.

Nasal polyps;Epstain-Barr virus infection;Pathological implications

10.3969/j.issn.1007-4856.2015.01.002

重庆市万州区科委重点科技计划项目（编号：20130323）浦东新区科技发展基金创新资金项目（PKJ2012-Y27）

1 重庆市万州区上海医院耳鼻咽喉科（404020）

2 宁夏医科大学

3 上海市浦东新区公利医院耳鼻咽喉科

4 上海凯普生物化学有限公司

陈晓平，主任医师.Email：chen_xp2000@163.com