正交试验法优选软脉灵颗粒提取工艺

郑美娟+王琼珺+胡娟

【摘 要】 目的：优选软脉灵颗粒最佳提取工艺条件。方法：以各投料药材干粉得率及干粉的指标性成分丹酚酸B含量为考察指标，采用正交试验法筛选工艺条件。结果：优选工艺为16味药材按一定比例混合，首先加8倍量水浸泡60min，沸后煎煮1 h;再分别加4、3倍量水，沸后各煎煮0.5h。结论：优选的提取工艺稳定、合理可行。

【关键词】 软脉灵颗粒;提取工艺;正交试验;丹酚酸B

【中图分类号】R283.6 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）15-0014-03

Orthogonal experiment to optimize extraction process of ruanmailing granules

ZHENG Mei-juan，WANG Qiong-jun，HU Juan

Zhangzhou vocational college of health， Fujian province，Zhangzhou 363000，china;

Institute of traditional Chinese medicine of Fujian province， Fuzhou City， Fujian province 350003，China

Abstract：Objective Optimal best extraction condition of Ruan Mai-Ling granules. Method Ginseng powder feeding rate and dry study of the indicator of the ingredient content of salvianolic acid b indicator filter ruanmailing granule by orthogonal design optimal extraction conditions.Results Optimizing process are： 16 mix the herbs in a certain， 60min first add 8 times times the volume of water immersion， after boiling decoction 1h; Plus 4， 3 times the amount respectively water， boiling， boiling after 0.5 h.Conclusion Optimum extraction process of a stable， rational， viable.

Keywords：Ruan Mai-Ling granules;Extraction technology;By orthogonal test;Salvianolic acid b

软脉灵是预防与治疗动脉粥样硬化的纯中药复方制剂，由熟地黄、五味子、枸杞、怀牛膝、茯苓、制何首乌、白芍、柏子仁、远志、炙黄芪、陈皮、淫羊藿、当归、川芎、丹参、人参等16味中药制成，具有滋补肝肾、益气活血的功效。临床应用多年未见明显的毒副作用，疗效确切，是脑动脉硬化、中风及冠心病等心脑血管疾病的理想药物[1、2]。然此方目前只有口服液剂型，存在服用周期长、口感欠佳、携带不便、保质期短等缺陷，难于适应现代社会防治疾病的需要。为给患者提供更加有效、方便的口服药物，笔者通过制剂工艺研究，在给药途径不变并保持原有药效的前提下，将口服液改进为颗粒剂，以提高其制备工艺水平和科技含量。参照原软脉灵口服液的提取过程，拟采用水提法，为使制剂工艺更加合理，在提取过程中采用L9（34）正交试验表，以丹酚酸B含量和干浸膏得率为考察指标，综合考察加水量、煎煮时间、煎煮次数等因素对软脉灵颗粒剂提取效果的影响，优选最佳提取工艺条件。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-2010AHT 高效液相色谱仪（包括自动进样器、二级管阵列检测器、Solution 色谱工作站）;FA2104N型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）;YB-z减压真空干燥箱（天津药典标准仪器厂）;中药材粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）;电热恒温水浴锅（宁波瑾瑞仪器设备有限公司）。

1.2 试药 熟地黄、五味子、枸杞、 怀牛膝、茯苓、制首乌、白芍、柏子仁、远志、炙黄芪、陈皮 淫羊藿、当归、川芎、丹参、人参等以上药材经漳州市药品检验所鉴定为合格药材。丹酚酸B对照品（批号：115939-201109，中国药品生物制品检定所）。乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

以各投料药材的干粉得率及干粉的指标性成分丹酚酸B含量为考察指标，以加水量、煎煮时间及煎煮次数为考察因素，进行三因素三水平的正交试验，优选最佳的水提取工艺条件。

2.1 干浸膏得率 将药材切碎过8目筛，按处方比例称取100.0g置于适宜的容器内，浸泡60min，按表1、2所设计的方案进行各试验的提取，并将提取液趁热用两层纱布过滤，合并滤液，浓缩成浸膏状，置于烘箱内60～80℃进一步完全干燥，取出称定重量，按下述公式（式 1）计算干浸膏得率。试验结果见表3。

干浸膏得率%=﹝干浸膏重量÷生药量﹞×100%（式1）

2.2 含量测定 丹酚酸B照2010版《中国药典》高效液相色谱法（附录Ⅵ D）测定。

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇∶乙腈∶甲酸∶水（30∶10∶1∶59）为流动相;检测波长为286nm。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于2000。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约0.2g，精密称定，置于适宜的具塞锥形瓶中，精密加75%的甲醇溶液50ml，称定重量，加热回流1h，取出，放冷，再称定重量，用75%的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。endprint

2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B对照品适量，加75%的甲醇溶液适量，制成每1ml含有丹酚酸B 0.14mg的溶液，即得。

2.2.4 测定法 分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本品以干燥品计算，含丹酚酸B（C36H30O16）不得低于3.0%。

2.3 正交实验 按处方比例称取熟地黄、枸杞、怀牛膝、茯苓、何首乌、远志、黄芪、淫羊藿、丹参等16味药材饮片共9份。照表1和表2所设计的因素水平条件进行各试验的提取、浓缩及干燥，并计算各投料药材的干粉得率，按上述含量测定方法测定各干粉中指标性成分丹酚酸B含量，按下述公式（式 2）计算综合得分，最后以综合得分筛选最佳的提取工艺条件。试验结果见表3。

综合得分=×[丹酚酸B提取率÷最大值）×0.5+（出膏率×最大值）×0.5]×100[3]（式 2）

表1中A、B、C各因素的分配关系，即各试验的煎煮次数、煎煮时间及加水量的关系，根据专业知识及预试验结果设计各试验的煎煮次数、煎煮时间及加水量的分配关系，见表2。

根据表2，如果实验因素水平为A2B2C2，即表示该实验提取总时间为2.0h，分2次进行提取，第一次加8倍量的水，沸后煎煮1 h;第二次加7倍量水，沸后煎煮1h;其余依此类推。

2.4 结果分析 比较表3水提取工艺正交试验的结果，各列水平情况：第1列A因素K2>K3>K1，第2列B因素K2>K3>K1，第3列C因素K3>K2>K1，所以提取条件A因素取2水平（A2），B因素取2水平（B2），C因素取3水平（C3）为优。并且由极差数据可知RC>RA>RB，说明A、B、C三个因素对实验结果的重要性为：C>A>B，即首先是煎煮次数，其次是加水量，最后是煎煮时间。同时由方差分析表4可知，煎煮次数和加水量的P<0.05，对实验结果有显著性影响，煎煮时间P>0.05，对实验结果无明显影响。根据正交试验结果，筛选出最佳的提取条件为C3A2B2，其综合得分为94.83分，即最佳水提取工艺为：16味药材，取当归、川芎、人参、陈皮、白芍、五味子、柏子仁等七味加适量水，水蒸气蒸馏，收集馏液，备用;所得药渣与其余熟地黄等9味混合，首先加8倍量的水浸泡60 min，沸后煎煮1 h;再分别加入4倍、3倍水，沸后各煎煮0.5 h。

2.5 验证试验 按处方比例称取药材，对上述优选的提取工艺条件进行3次重复试验，结果见表5。

从表5可知，在优选工艺条件下干浸膏得率和丹酚酸B含量的波动较小，并且与水提取工艺优选的试验结果基本吻合，，说明经正交试验优选的水提取工艺条件稳定，具有良好的重现性和可操作性。

3 讨论

3.1 水提取工艺 为了保证软脉灵颗粒的临床疗效与原口服液一致，在提取工艺的设计中，应尽可能地保持原口服液的生产加工工艺，以水为溶剂的煎煮提取工艺与原口服液的提取工艺十分相近，因此采用水煎煮法提取，以保证制剂的临床疗效。

3.2 优选指标的设计 丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功效，在此方中为臣药，考虑到丹酚酸B的药理作用更能反应软脉灵颗粒的临床疗效。丹参的指标性成分可分为脂溶性和水溶性成分，水溶性主要为酚酸类成分，包括丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、丹参素以及原儿茶醛等。药理实验研究表明，丹参酚酸类成分具有抗凝及抗氧化活性，对动脉粥样硬化有预防和治疗作用。丹参水溶性成分中含量最高的是丹酚酸B，约占3.0%，可作为工艺优选的指标[4]。基于以上分析，确定丹酚酸B作为该制剂工艺优选的考察指标之一。考虑到用单一考察指标筛选中药提取工艺条件不够全面，笔者在软脉灵颗粒剂水提取工艺的优选实验中，采用丹酚酸B含量和干浸膏得率2个指标评价法，以综合考察提取工艺的优劣。

3.3 实验中发现不同产地的丹参药材，丹酚酸B含量有一定的差异，这与资料[5]记载一致。因此，在实际的生产过程中，为了保证制剂的质量稳定、可靠，在选择丹参药材时应该重视其产地。

参考文献

[1]林友愉.软脉灵治疗冠心病心绞痛的临床疗效[J].海峡药学，2009，8（6）：174-175.

[2]游雯等.软脉灵治疗高脂血症的临床观[J].海峡药学，2009，6（7）：155-156.

[3]赵琳，童晓青，佟占柱.肾石消片提取工艺研究[J].时珍国医国药，2007，12（5）：206-207.

[4]孙红丽.HPLC法同时测定丹参冲剂中丹酚酸B的含量[J].黑龙江医药，2009，22（3）：268-269.

[5]徐山.不同产地丹酚酸B的含量测定[J].山东中医药大学学报，2011，35（5）：178-179.

（收稿日期：2014.06.08）endprint

2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B对照品适量，加75%的甲醇溶液适量，制成每1ml含有丹酚酸B 0.14mg的溶液，即得。

2.2.4 测定法 分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本品以干燥品计算，含丹酚酸B（C36H30O16）不得低于3.0%。

2.3 正交实验 按处方比例称取熟地黄、枸杞、怀牛膝、茯苓、何首乌、远志、黄芪、淫羊藿、丹参等16味药材饮片共9份。照表1和表2所设计的因素水平条件进行各试验的提取、浓缩及干燥，并计算各投料药材的干粉得率，按上述含量测定方法测定各干粉中指标性成分丹酚酸B含量，按下述公式（式 2）计算综合得分，最后以综合得分筛选最佳的提取工艺条件。试验结果见表3。

综合得分=×[丹酚酸B提取率÷最大值）×0.5+（出膏率×最大值）×0.5]×100[3]（式 2）

表1中A、B、C各因素的分配关系，即各试验的煎煮次数、煎煮时间及加水量的关系，根据专业知识及预试验结果设计各试验的煎煮次数、煎煮时间及加水量的分配关系，见表2。

根据表2，如果实验因素水平为A2B2C2，即表示该实验提取总时间为2.0h，分2次进行提取，第一次加8倍量的水，沸后煎煮1 h;第二次加7倍量水，沸后煎煮1h;其余依此类推。

2.4 结果分析 比较表3水提取工艺正交试验的结果，各列水平情况：第1列A因素K2>K3>K1，第2列B因素K2>K3>K1，第3列C因素K3>K2>K1，所以提取条件A因素取2水平（A2），B因素取2水平（B2），C因素取3水平（C3）为优。并且由极差数据可知RC>RA>RB，说明A、B、C三个因素对实验结果的重要性为：C>A>B，即首先是煎煮次数，其次是加水量，最后是煎煮时间。同时由方差分析表4可知，煎煮次数和加水量的P<0.05，对实验结果有显著性影响，煎煮时间P>0.05，对实验结果无明显影响。根据正交试验结果，筛选出最佳的提取条件为C3A2B2，其综合得分为94.83分，即最佳水提取工艺为：16味药材，取当归、川芎、人参、陈皮、白芍、五味子、柏子仁等七味加适量水，水蒸气蒸馏，收集馏液，备用;所得药渣与其余熟地黄等9味混合，首先加8倍量的水浸泡60 min，沸后煎煮1 h;再分别加入4倍、3倍水，沸后各煎煮0.5 h。

2.5 验证试验 按处方比例称取药材，对上述优选的提取工艺条件进行3次重复试验，结果见表5。

从表5可知，在优选工艺条件下干浸膏得率和丹酚酸B含量的波动较小，并且与水提取工艺优选的试验结果基本吻合，，说明经正交试验优选的水提取工艺条件稳定，具有良好的重现性和可操作性。

3 讨论

3.1 水提取工艺 为了保证软脉灵颗粒的临床疗效与原口服液一致，在提取工艺的设计中，应尽可能地保持原口服液的生产加工工艺，以水为溶剂的煎煮提取工艺与原口服液的提取工艺十分相近，因此采用水煎煮法提取，以保证制剂的临床疗效。

3.2 优选指标的设计 丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功效，在此方中为臣药，考虑到丹酚酸B的药理作用更能反应软脉灵颗粒的临床疗效。丹参的指标性成分可分为脂溶性和水溶性成分，水溶性主要为酚酸类成分，包括丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、丹参素以及原儿茶醛等。药理实验研究表明，丹参酚酸类成分具有抗凝及抗氧化活性，对动脉粥样硬化有预防和治疗作用。丹参水溶性成分中含量最高的是丹酚酸B，约占3.0%，可作为工艺优选的指标[4]。基于以上分析，确定丹酚酸B作为该制剂工艺优选的考察指标之一。考虑到用单一考察指标筛选中药提取工艺条件不够全面，笔者在软脉灵颗粒剂水提取工艺的优选实验中，采用丹酚酸B含量和干浸膏得率2个指标评价法，以综合考察提取工艺的优劣。

3.3 实验中发现不同产地的丹参药材，丹酚酸B含量有一定的差异，这与资料[5]记载一致。因此，在实际的生产过程中，为了保证制剂的质量稳定、可靠，在选择丹参药材时应该重视其产地。

参考文献

[1]林友愉.软脉灵治疗冠心病心绞痛的临床疗效[J].海峡药学，2009，8（6）：174-175.

[2]游雯等.软脉灵治疗高脂血症的临床观[J].海峡药学，2009，6（7）：155-156.

[3]赵琳，童晓青，佟占柱.肾石消片提取工艺研究[J].时珍国医国药，2007，12（5）：206-207.

[4]孙红丽.HPLC法同时测定丹参冲剂中丹酚酸B的含量[J].黑龙江医药，2009，22（3）：268-269.

[5]徐山.不同产地丹酚酸B的含量测定[J].山东中医药大学学报，2011，35（5）：178-179.

（收稿日期：2014.06.08）endprint

2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B对照品适量，加75%的甲醇溶液适量，制成每1ml含有丹酚酸B 0.14mg的溶液，即得。

2.2.4 测定法 分别精密吸取供试品溶液及对照品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得。本品以干燥品计算，含丹酚酸B（C36H30O16）不得低于3.0%。

2.3 正交实验 按处方比例称取熟地黄、枸杞、怀牛膝、茯苓、何首乌、远志、黄芪、淫羊藿、丹参等16味药材饮片共9份。照表1和表2所设计的因素水平条件进行各试验的提取、浓缩及干燥，并计算各投料药材的干粉得率，按上述含量测定方法测定各干粉中指标性成分丹酚酸B含量，按下述公式（式 2）计算综合得分，最后以综合得分筛选最佳的提取工艺条件。试验结果见表3。

综合得分=×[丹酚酸B提取率÷最大值）×0.5+（出膏率×最大值）×0.5]×100[3]（式 2）

表1中A、B、C各因素的分配关系，即各试验的煎煮次数、煎煮时间及加水量的关系，根据专业知识及预试验结果设计各试验的煎煮次数、煎煮时间及加水量的分配关系，见表2。

根据表2，如果实验因素水平为A2B2C2，即表示该实验提取总时间为2.0h，分2次进行提取，第一次加8倍量的水，沸后煎煮1 h;第二次加7倍量水，沸后煎煮1h;其余依此类推。

2.4 结果分析 比较表3水提取工艺正交试验的结果，各列水平情况：第1列A因素K2>K3>K1，第2列B因素K2>K3>K1，第3列C因素K3>K2>K1，所以提取条件A因素取2水平（A2），B因素取2水平（B2），C因素取3水平（C3）为优。并且由极差数据可知RC>RA>RB，说明A、B、C三个因素对实验结果的重要性为：C>A>B，即首先是煎煮次数，其次是加水量，最后是煎煮时间。同时由方差分析表4可知，煎煮次数和加水量的P<0.05，对实验结果有显著性影响，煎煮时间P>0.05，对实验结果无明显影响。根据正交试验结果，筛选出最佳的提取条件为C3A2B2，其综合得分为94.83分，即最佳水提取工艺为：16味药材，取当归、川芎、人参、陈皮、白芍、五味子、柏子仁等七味加适量水，水蒸气蒸馏，收集馏液，备用;所得药渣与其余熟地黄等9味混合，首先加8倍量的水浸泡60 min，沸后煎煮1 h;再分别加入4倍、3倍水，沸后各煎煮0.5 h。

2.5 验证试验 按处方比例称取药材，对上述优选的提取工艺条件进行3次重复试验，结果见表5。

从表5可知，在优选工艺条件下干浸膏得率和丹酚酸B含量的波动较小，并且与水提取工艺优选的试验结果基本吻合，，说明经正交试验优选的水提取工艺条件稳定，具有良好的重现性和可操作性。

3 讨论

3.1 水提取工艺 为了保证软脉灵颗粒的临床疗效与原口服液一致，在提取工艺的设计中，应尽可能地保持原口服液的生产加工工艺，以水为溶剂的煎煮提取工艺与原口服液的提取工艺十分相近，因此采用水煎煮法提取，以保证制剂的临床疗效。

3.2 优选指标的设计 丹参具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦等功效，在此方中为臣药，考虑到丹酚酸B的药理作用更能反应软脉灵颗粒的临床疗效。丹参的指标性成分可分为脂溶性和水溶性成分，水溶性主要为酚酸类成分，包括丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸C、丹参素以及原儿茶醛等。药理实验研究表明，丹参酚酸类成分具有抗凝及抗氧化活性，对动脉粥样硬化有预防和治疗作用。丹参水溶性成分中含量最高的是丹酚酸B，约占3.0%，可作为工艺优选的指标[4]。基于以上分析，确定丹酚酸B作为该制剂工艺优选的考察指标之一。考虑到用单一考察指标筛选中药提取工艺条件不够全面，笔者在软脉灵颗粒剂水提取工艺的优选实验中，采用丹酚酸B含量和干浸膏得率2个指标评价法，以综合考察提取工艺的优劣。

3.3 实验中发现不同产地的丹参药材，丹酚酸B含量有一定的差异，这与资料[5]记载一致。因此，在实际的生产过程中，为了保证制剂的质量稳定、可靠，在选择丹参药材时应该重视其产地。

参考文献

[1]林友愉.软脉灵治疗冠心病心绞痛的临床疗效[J].海峡药学，2009，8（6）：174-175.

[2]游雯等.软脉灵治疗高脂血症的临床观[J].海峡药学，2009，6（7）：155-156.

[3]赵琳，童晓青，佟占柱.肾石消片提取工艺研究[J].时珍国医国药，2007，12（5）：206-207.

[4]孙红丽.HPLC法同时测定丹参冲剂中丹酚酸B的含量[J].黑龙江医药，2009，22（3）：268-269.

[5]徐山.不同产地丹酚酸B的含量测定[J].山东中医药大学学报，2011，35（5）：178-179.

（收稿日期：2014.06.08）endprint