Bacillus cereus MBRH3的鉴定及以海带为原料生产SOD

郝之奎， 潘 勇， 杨甫岳， 陈 怡， 董玲玲， 王 科， 吴莉萍， 沈泽航

（台州职业技术学院 应用生物技术研究所，浙江 台州318000）

Bacillus cereus MBRH3的鉴定及以海带为原料生产SOD

郝之奎， 潘 勇， 杨甫岳， 陈 怡， 董玲玲， 王 科， 吴莉萍， 沈泽航

（台州职业技术学院 应用生物技术研究所，浙江 台州318000）

从浙江省台州市剑门港海区采集海底淤泥样本，以海带作为唯一营养因子筛选出3株SOD产生菌，并对其中1株产SOD活性较高的菌株从从形态学、生理生化及分子生物学特征等方面进行了鉴定，该菌属于芽胞杆菌科（Bacillaceae），芽胞杆菌属（Bacillus），蜡样芽胞杆菌（cereus），命名为Bacillus cereus MBRH3。利用中心组合设计实验（Contral Composite Design）对该菌株的产酶培养基进行了优化，结果表明，当培养基主要成分玉米浆粉、海带浆、葡萄糖和硫酸锰质量浓度（g/L）分别为4.5、4.11、2.10和0.62时，SOD活性最高达到203.38 U/mL。还未曾发现该菌能够利用海带生产SOD的文献报道。本菌株保藏于中国典型微生物保藏中心（保藏号：CCTCC NO：M2013581）。

蜡样芽胞杆菌；SOD；分离；鉴定；发酵优化

超氧化物歧化酶 （EC 1.15.1.1，Superoxide dismutase，SOD）是活细胞产生的专一性催化生物体内超氧阴离子自由基（O-2）发生歧化反应生成过氧化氢和氧气的金属酶，它维持生物体内自由基的产生和清除的动态平衡，对生物具有保护、防衰和治病作用。SOD是金属酶，根据其结合的不同金属离子可分为Fe-SOD、Mn-SOD和Cu·Zn-SOD。原核细胞及部分植物主要含有Fe-SOD，呈黄色。真核细胞线粒体及原核细胞中含有Mn-SOD，呈紫色。植物的叶绿体、过氧化物酶体及真核细胞细胞浆内含有较多的Cu·Zn-SOD，呈蓝绿色[1]。近年来，学者们在链霉菌属中发现了Ni-SOD和Fe·Zn-SOD，在牛肝中发现了Co·Zn-SOD[2]，SOD的种类日益丰富。SOD应用非常广泛：在医药领域，SOD可治疗因O-2引起的疾病，如关节炎和类风湿性关节炎等；在食品领域，SOD可作为保健食品的添加剂，具有抗疲劳、抗衰老、抗辐射和消炎作用，还可用于水果保鲜；在日化领域，SOD具有防晒、抗皱、祛斑、抗炎作用；在农业和植保领域，SOD具有提高抗逆性能和耐受性等。

活的动物、植物及微生物细胞都能产生SOD，但是不同的生物产SOD的强度差异很大，同一生物体的不同部位SOD的差异也很大。动物内脏和血液曾是SOD的主要来源[3]，但是，来源于动物的SOD易造成交叉感染和过敏反应等不良后果，应用受到很大限制。植物中特别是大豆、玉米、桑叶、大蒜及仙人掌等含量相对较高[4-6]，但其提取工艺复杂，以致生产成本较高而不能大量生产。微生物发酵获取SOD是现在最常用的方法，王岁楼[7]、王素芳[8]等学者筛选获得SOD高产菌，通过发酵SOD酶活分别达600 U/g湿菌体和比活3 048 U/mg，微生物发酵生产SOD具有产量高、工艺简单等显著优势，是获取SOD的主要方法，特别是利用现在分子生物技术的构建的产SOD的工程菌，使通过发酵获得SOD更加有效[9]。

海带是多年生大型藻类，我国海带产量约90万t/年，是世界总产量的一半，排第一位[10]。海带不仅具有食用价值，还是一种高附加值的工业原料。海带的主要成分是褐藻胶，同时富含碘、钙等矿质元素及多种氨基酸和维生素。海带营养丰富，其含量最多的海带多糖具有抑制肿瘤生长、改善肾功能衰竭、降低血脂、降低血压等药理作用，是天然的保健食品，为我国及东南亚诸多国家的人们所喜爱。以海带为原料可生产褐藻胶、甘露醇、膳食纤维和海藻酸钠等重要工业原料或食品。此外，还可以海带为原料发酵制造乳酸、乙醇甚至饮料等。我国虽是海带产量大国和海带加工大国，但是海带加工水平与世界发达国家相比还有一段距离。深入开展海带应用潜能研究是提高海带利用价值有效途径[11]。作者在开发海洋微生物资源过程中，以海带为唯一营养筛选获得一株能利用海带为底物合成SOD的微生物菌种。多糖类物质在自由基清除过程中叶发挥重要作用[12]。特别是海带中含有的褐藻糖胶自身有较强的清除氧自由基的作用，与SOD功能相同[13]，选择海带作为生产SOD的原料更能够发挥其优势。

1 材料与方法

1.1 材料

样本采自于浙江省台州市剑门港海区海底淤泥（28°1′57″N，121°36′38″E），共10份。

1.2 主要仪器

紫外分光光度计：UV-3000，HITACHI公司产品；光学显微镜：ECLIPSE公司产品。

1.3 试剂及培养基

市售海带，纯净水浸泡24 h，切块后使用豆浆机充分粉碎，调配成干物质质量分数为5%的海带浆，低温储存备用。

发酵培养基 （g/L）：MnSO4·7H2O 0.5，KH2PO40.7，K2HPO40.3，葡萄糖2，玉米浆粉2，牛肉膏2，海带浆2 mL，pH 7.0。

1.4 目标菌株的分离筛选

取2 g海底淤泥样本加入以海带为唯一营养成分的培养基中，35℃，200 r/min，条件下培养108 h，取5 mL发酵液，加入50 mL无菌水中充分混合，依次稀释制101~106倍，然后取104和105两个稀释倍数的样品各0.2 mL分别均匀涂在仍仅有海带为培养基的平板上，37℃培养72 h。后挑选单菌落在新的筛选培养基平板上划线转接，直至获得单菌落纯培养物，接着进一步复筛或4℃保存备用。

1.5 目标菌株的复筛

把初筛得到的菌株接种至含有海带的培养基中，600 nm检测其生长情况，当菌种浓度达2.20时取1 mL种子分别接种于产酶培养基中。35℃、200 r/min条件下培养48 h检测酶活。每个样品进行了3个平行实验，灭菌水做对照，SOD酶活为3个平行实验的平均值。

1.6 SOD酶活性的测定方法

SOD酶活测定参照参考文献[14]采用微量连苯三酚自氧化法测定，取待测培养液1 mL离心后取上清液0.1mL和3 mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液（含EDTA 1 mmol/L，pH 8.2）0.1 mL连苯三酚溶液（0.05 mol/L，0.1 mol/L盐酸配制）组成总体系，缓冲液35~37℃预热。在波长325 nm下测吸光度，以灭活等量酶液作空白对照。酶活定义：在一定条件下，1 mL的反应液中，每分钟抑制连苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活力单位（U）

SODactivity（U/mL）=2（ΔA325-Δ’A325）/ΔA325× 3.2×n/V

（ΔA325为连苯三酚自氧化时的A325读数差，Δ’A325为添加酶液后A325读数差，3.2为测定的反应液体积，n为酶液稀释倍数，V为用于反应的酶液体积。）

1.7 菌株的生理生化及形态学鉴定

菌株形态及生理生化实验参照工业微生物实验技术手册[15-16]和伯杰氏细菌鉴定手册[17]。

1.8 菌株的分子生物学研究

DNA的提取[18]：种子于200 r/min，30℃条件下发酵10 h，8 000 g冷冻离心10 min，收集菌体。总DNA提取方法按照试剂盒方法进行（细菌基因组提取试剂盒：上海赛百盛基因技术有限公司产品）。

利用通用引物扩增16S rRNA基因。引物由上海赛百盛基因技术有限公司合成：5’-GAGTTTGATCCTGGCTCA -3’ 和 5’ -CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’[19]。PCR反应条件为：94℃预变性 4 min，进入循环，94℃变性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸2 min，35个循环，72℃延伸10 min后保存4℃状态。PCR产物用UltraClean PCR Clean-up kit纯化，及时送上海生物工程有限公司测序。

序列及系统发育分析：通过BLAST（http：//www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）将菌株SYBC-H1的16S rRNA基因序列进行同源分析。多序列比对应用软件Clustal W（V 1.83）[20]，用 BioEdit（V 7.01）进行序列调整。最后用Mega软件（V 5.1）采用邻位相连法（neighbor-joining，NJ）构建 （Kimura 2-parameter distance calculation）进化树[21]。1000 bootstrap检验[22]。

1.9 产SOD培养基的优化

采用中心组合试验 （Central Composite Design，CCD）方法，使用软件Dsign-Expert进行实验设计与分析。利用单因素实验筛选出对产SOD有潜在影响的4种培养基成分，进一步确定培养基各成分的最佳含量并验证。

发酵培养条件为：温度：35℃；转速：200 r/min；装液量：50 mL；接种量体积分数2%；培养时间：48 h。数据取3个平行实验的平均值，显著性分析采用t-检验，P<0.05视为显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 SOD产生菌的筛选

经过利用仅有海带为营养的培养基的筛选，得到了3株可利用海带为营养的微生物，微生物大都产生SOD，对初筛得到的菌株进一步复筛，获得一株酶活相对较高的作为进一步深入研究的菌株。

2.2 菌株MBRH3的鉴定

2.2.1 MBRH3的生理生化及形态学特征MBRH3菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，乳白色不透明，菌体粘稠不易挑起（图 2（a)）；菌体长度约1.1~2.5 μm，直径约0.5~1.0 μm；杆状成链（图 2（b））。生理生化实验结果表明，该菌是革兰氏阳性菌；在5℃至45℃温度范围内都可生长，最适生长温度为35℃，pH为3.5~8.5时都可生长，最佳生长pH是6.5。兼性好氧。能利用的碳源有：蔗糖、N-乙酰氨基葡萄糖、壳二糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、菊粉、麦芽糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖等。能分泌的酶如下：过氧化氢酶、半乳糖酶、β-葡萄糖苷酶、尿酶、蔗糖酶、麦芽糖酶、淀粉酶等。

2.2.2 菌株Bacillus cereus MBRH3的16S rRNA基因序列测定及聚类分析通过分子生物学手段获得MBRH3的16S rRNA基因，测序片段总长1，251 bp。登录http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.利用blast进行同源性分析，结果显示，与Bosea sp.BIWAKO-01（AB425327.1）最接近，Max Ident达到99%。根据blast结果，选择有代表性的菌株使用软件Mega3.1利用临接法（Neighbor-Joinning）构建系统发育树（图2）。

从形态学、生理生化及分子生物学特征鉴定表明，该菌属于芽胞杆菌科（Bacillaceae），芽胞杆菌属（Bacillus），蜡样芽胞杆菌（cereus），命名为Bacillus cereus MBRH3。对于该菌能够以海带为原料生产SOD还未曾见过文献报道。本菌株保藏于中国典型微生物保藏中心（保藏号：CCTCC NO：M2013581）。

图1 Bacillus cereus MBRH3的菌落(a)及显微照片(b) Fig.1 Clone(a)and micrographs(b)of Bacillus cereus MBRH3.sequences

图2 基于16S rRNA基因序列构建的NJ系统发育树Fig.2 Neighbor-joining tree resulting from analysis of the 16Sr RNA gene sequences

2.3 产酶条件的优化实验结果

利用海带生产SOD是本实验的出发点。采用单因素优化法确认对SOD产量有潜在影响的玉米浆粉、海带浆、葡萄糖及硫酸锰等营养因子，并通过爬坡实验确认该营养因子的大致水平，然后使用中心组合设计法（CCD）优化培养基。中心组合设计水平、编码及实验结果见表2-6。软件拟合所得二次多项式方程式为：

中心组合实验设计方差及回归分析如表2。由表可知，模型p=0.005 4＜0.05，说明该模型在99.5%的概率水平下是显著的。而失拟合不显著（p=0.051 7＞0.05），说明模型中无需再引入其他因素。决定系数R2=0.985 7，说明98.57%实验变化情况都可以用该模型解释，R2adj=0.935 7，与R2相符，表明SOD条件优化发酵模型是基本合理的。图3表明，观测值与预测值都分布在同一直线附近，进一步说明该模型与事实是相符的。二次方系数的值分别是-19.69，-14.17、-25.49和-19.53，说明抛物线开口向下，可求出最大值。对回归方程进行求导，结合图4，图5、图6、图7和图8的三维响应面，求得该模型的最大值，X1=1，X2=0.74，X3=0.2和X4=0.61，对应的玉米浆粉、海带浆、葡萄糖和硫酸锰的实际值（g/L）分别为4.50，4.11，2.10和0.62，此模型的最大响应值为，203.38 U/ml。实验结果显示MBRH3发酵产SOD的过程中，海带的作用是显著的（P2=0.002＜0.05），这与以海带为唯一营养物质筛选的目标菌株相一致。也说明该菌株具有一定的特异性，他能很好利用海带。葡萄糖是微生物可直接利用的能源物质，本实验也显示葡萄糖对 SOD的产生影响显著 （P2= 0.002＜0.0165）。

图4反映了玉米浆和海带两种营养之间的关系以及对产SOD的影响，显著性检验显示P（0.096 8）＞0.05，说明它们之间的交互作用是不显著的，也就是说不管他们的值处于高水平还是低水平，其产酶能力都不能达到最大值。ANOVA分析显示玉米浆粉与海带浆之间、玉米浆粉与葡萄糖之间、玉米浆粉与硫酸锰之间以及海带浆和葡萄糖之间相关性都不显著（表2），但是从图5～9可知，各种营养因子对产SOD的影响都符合正态分布，说明该类物质作为产SOD的原料被微生物利用符合一般规律。作为产SOD的几种主要营养物质，只有葡萄糖与硫酸锰之间的交互作用显著（p=0.035＜0.05）的，改变他们在培养基里的浓度使其达到某一水平时可使产酶能力达到最大值。在产SOD过程中，葡萄糖与硫酸锰之间相互影响显著地原因可能是葡萄糖在被利用时，会产酸，造成发酵环境的pH值改变，发酵体系的pH值改变也会影响硫酸锰的吸收或改变了SOD的结构，这种改变又对菌株利用葡萄糖产生影响，这也从侧面说明该SOD与锰关系密切，属于Mn-SOD。

表1 中心组合设计水平、编码及实验结果Table 1 Experimental design and results of the central composite design

表2 中心组合实验设计方差及回归分析Table 2 Analysis of variance(ANOVA)and regression for chitinnase production

图3 观测值与预测值之间关系图Fig.3 Plot of predicted vs actual chitinase activity(U/mL values)

图4 玉米浆粉及海带浆对SOD活性的影响三维图Fig.4 3D response surface curve for effects of Corn steep powder,Sea weed paste and their mutual interaction

图5 玉米浆粉及海带浆对SOD活性的影响三维图Fig.5 3D response surface curve for effects of Corn steep powder,glucose and their mutual interaction

图6 玉米浆粉及硫酸锰对SOD活性的影响三维图Fig.6 3D response surface curve for effects of Corn steep powder,magnesium sulfate and their mutual interaction

图7 海带浆及葡萄糖对SOD活性的影响三维图Fig.7 3D response surface curve for effects of Sea weed paste,glucose and their mutual interaction

图8 海带浆及硫酸锰对SOD活性的影响三维图Fig.8 3D response surface curve for effects of Sea weed paste,magnesium sulfate and their mutual interaction

图9 葡萄糖及硫酸锰对SOD活性的影响三维图Fig.9 3D response surface curve for effects of glucose，magnesium sulfate and their mutual interaction

3 结语

细胞在代谢活动中都会产生活性氧（reactive oxygen species），这样就必然激活细胞的自我保护机制，产生SOD消除氧自由基是活细胞免受其毒害的主要途径之一。海洋微生物在温度、压力、渗透压等复杂的不良环境剧烈变化胁迫下，会产生大量活性氧，这种恶劣条件也必促使微生物增强其合成SOD的强度以消除氧自由基的毒害，长期的进化使海洋微生物形成了完善的抗氧化机制，从合成SOD这个角度来看，海洋微生物与陆源微生物相比具有更大的优势和潜力。海带自身含有SOD，其主要成分海带多糖也具有清理氧自由基的功能，以海带为原料利用海洋微生物生产SOD可使其优势充分发挥。

对MBRH3产SOD培养基的优化是挖掘其产酶潜力的最有效途径，在资源日益匮乏的条件下，选择廉价的生产原料对降低生产成本尤为重要，以廉价的海带、玉米浆粉和葡萄糖为主要原料生产SOD有着成本优势，是SOD产业化过程的有意义探索。

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Identification and Improvement of SOD Production for Bacillus cereus MBRH3

HAO Zhikui， PAN Yong， YANG Fuyue， CHEN Yi，DONG Lingling， WANG Ke， WU Liping， SHEN Zhehang
（Institute of Applied Biotechnology，Taizhou Vocational&Technical College，Taizhou 318000，China）

Three Microorganism with SOD production were separated from the seafloor mud of Jianmen harbour in Taizhou，Zhejiang Province，China.Thus，further studying on one of the stronger SOD activity strain was undertaken，Its phenotype，genetic and phylogenetic analysis experiments suggested that the strain belongs to the family Bacillaceae，genus Bacillus and named as Bacillus cereus MBRH3.A sequential statistical methodology comprising of Contral Composite Design were applied to enhance the fermentative production of SOD，As a result，maximum chitinase activity of 203.38 U/mL was obtained in the optimized medium concentration（g/L）of 4.5 corn steep powder，4.11 Sea weed paste，2.10 glucose and 0.62 magnesium sulfate.Bacteria was deposited into China Center for Type CultureCollection（CCTCC NO：M2013581）.

Bacillus cereus MBRH3，SOD，isolation，identification，fermentation optimization

S 946.1

A

1673—1689（2015）01—0054—08

2014-05-18

浙江省教育厅科研计划项目（Y20125673）；大学生科技创新项目（2013R460001）；台州市海洋生物资源开发与利用科技创新团队项目（台市委办发[2012]58号，MBR2012032）；浙江省教育厅高等学校访问工程师校企合作项目（FW2012048）。

郝之奎（1972—），男，安徽阜阳人，工学博士，工程师，主要从事海洋微生物资源开发与利用研究。E-mail：haozhikui123@126.com