重编程：生物学的黑匣子

重编程：生物学的黑匣子

重编程，意即把已分化的细胞逆转回胚胎状态，使其拥有可以发育成所有细胞类型的非凡能力，卵子与精子结合形成胚胎的过程也可以被看作一种重编程。从20世纪60年代，英国科学家约翰·戈登（John Gurdon）用蝌蚪的肠道细胞培育出一只的青蛙，到1996年，伊恩·威尔穆特（Ian Wilmut）用成体哺乳动物的细胞创造了多莉羊，重编程的研究已经走过了几十年的光阴。

2006年，研究人员对于重编程的兴趣迅速上升，因为研究证明，仅需转入4个基因，成熟的小鼠细胞就能被重编程，变为诱导多能干细胞（ips）。这种方法非常简单，几乎所有的实验室都可尝试，现在该领域每年发表的论文超过1000篇。2014年，用多能细胞修复受损或患病组织的梦想已经部分变成了现实，ips细胞分化出的视网膜细胞被移植到患有眼疾的女性体内，这是重编程细胞首次移植到人体内。

但是，没人知道这是怎么发生的，连许多专门研究重编程的科学家也解释不了。他们只知道，重编程就像生物学的一个黑匣子，分化细胞从这头进去，多能干细胞就会从那头出来，这中间发生了什么却不得而知。日本京都大学iPS细胞研究和应用中心的分子生物学家克努特·沃尔特詹（Knut Woltjen）表示：“我们采用了许多研究手段，但重编程仍然令人感到困惑，我们正在做一件非常复杂的事。”

干细胞生物学家指出，问题之一在于，实验材料总是细胞的混合物，其中每一个细胞的分子状态都有些许不同。制造iPS细胞的过程通常效率低下，充满变数：只有很小一部分细胞能够被完全重编程，甚至这些重编程细胞之间还有着微妙但重要的区别。更重要的是，在不同实验室中，重编程路径可能根据细胞的生长条件不同而变化，因此难以对比已知的实验结果。如果对细胞混合物的特征了解得不够，就将其用于临床则会引发安全上的担忧。

不过，最近出现的新技术正在逐渐 打开黑匣子。通过对单个细胞进行细致的分析、积累详细的分子数据，生物学家正在探索重编程中发生的许多重要事件。最近，规模最大的重编程研究 国 际 合 作 计 划——“宏 伟 计 划 ”（Project Grandiose），公布了目前取得的进展。项目团队采用一系列实验，拍摄了重编程每个阶段的高精度图像，发现了多能性的另一种状态。“这是对细胞状态随时间变化的首次高精度分析，”项目领导者、加拿大多伦多西奈山医院干细胞生物学家安德拉斯·纳吉（Andras Nagy）认为，“毫不夸张地说，这是一项宏伟的事业”。

但是，要想进一步操控这一过程，轻而易举地得到治疗性细胞，科学家还有很多工作要做。“不错，我们能获得ips细胞，也能使它们分化，但我认为，我们还不能控制它们，”以色列魏茨曼科学研究所的干细胞生物学家雅各布·汉纳 （Jacob Hanna）说，“随心所欲地控制细胞行为听上去很酷，但要达到这个目的，我们必须获得大量资料，详细掌握细胞的分子生物学特性。”

从核移植到iPS

戈登和威尔穆特在重编程青蛙和绵羊的细胞时，采用的方法几乎一致：把卵细胞的DNA剥离，植入已分化细胞的细胞核。科学家知道，卵细胞中的某些物质能使细胞核重编程，比如关闭与皮肤细胞相关的基因，而开启那些与多能性相关的基因，进而触发一系列的分子事件。在接下来的十年中，研究人员开发了各种新的重编程方式，例如向受精卵和胚胎干细胞植入细胞核，但这些方法都没能弄清楚，究竟是细胞中的什么成分启动了重编程，这个过程又是如何工作的。

2006年，日本京都大学的山中伸弥（Shinya Yamanaka）和高桥和利（Kautoshi Takahashi）制造出了iPS细胞，改变了一切。他们发现，早期胚胎或胚胎干细胞中的4种蛋白，可以重编程成体细胞，这就为研究人员提供了在培养皿中研究重编程的关键工具。现在，干细胞生物学家确信，引入这些被称作“山中因子”的蛋白后，细胞内会引发一阵强烈的、可预测的基因表达。然而，几天以后，细胞就会进入一个神秘状态：细胞会一直分裂，但一直停滞在这个状态。一周后，大概只有千分之一的细胞成为真正的多能细胞。

这个过程不可预知，我们也不可能知道最初是哪些细胞被重编程，重编程为何需要较长时间，不过，某些方面也是可以预见的。“在德国，日本和美国，研究人员可以在同样的时间以相同的速率获得iPS细胞，”哈佛大学的亚历山大·迈斯纳（Alexander Meissner）指出，“我们知道这不是魔术，而是一种机制，这是个好消息，我们应该能找到它，”可是，目前进展不大，“几乎令人失望”。

几天以后，细胞就会进入一个神秘状态：细胞会一直分裂，但一直停滞在这个状态。一周后，大概只有千分之一的细胞能成为真正的多能细胞。

从细胞的角度来看，分化就像生物学上的“锁”，要逆转完全的分化状态是个巨大的挑战。我们以成纤维细胞为例，这种细胞来自皮肤的结缔组织，科学家经常用它们做重编程试验。成纤维细胞带有独特的身份印记——它们的DNA具有表观遗传学标记，比如甲基或组蛋白修饰（组蛋白与染色体结构密切相关）。因为有这些标记的存在，在正常的成纤维细胞中，只有与这类细胞相关的基因才能得以表达，否则皮肤细胞会像正在分化的干细胞，而这可能是癌症等疾病的病发途径。

现在，科学家对引入“山中因子”这种强力因素之后的最初48小时非常感兴趣。在胚胎干细胞中，这些蛋白会激活“多能性网络”中的基因，让干细胞保持无限增殖的能力。但是，一旦被引入到成纤维细胞等成熟细胞中，这些蛋白的作用方式又有不同。美国宾夕法尼亚大学的细胞生物学家肯·扎雷特（Ken Zaret）把“山中因子”引入成纤维细胞后，在最初两天内跟踪观测了这些因子的位置。结果他发现，受阻于细胞染色体的结构，“山中因子”无法接触到目标基因。

相反，这些蛋白会结合到染色体的其他区域。有时，它们会激活细胞的自杀基因；有时，它们会结合到名为“增强子”的、负责调控基因表达的区域上，增强与重编程过程相关的基因的表达。麻省理工学院的干细胞生物学家鲁道夫·詹尼施（Rudolf Jaenisch）认为，“山中因子”与染色体的结合是“杂乱无章”的。

也有研究指出，在重编程的早期阶段，细胞的染色体也会发生全面变化。在2011年发表的一项研究中，迈斯纳的研究小组发现，一种名为H3K4me2的组蛋白修饰在细胞基因组的1000多个位点上发生了变化：这种修饰出现在了“多能性基因”的多个位点上，而在成纤维细胞的特异性基因上，这种修饰消失了。与此同时，细胞的外观和行为特征也出现不同：细胞之间更紧凑，移动较少。

迈斯纳表示：“我们最初的想法是，‘山中因子’会造成混乱，但从我们的研究来看，重编程的第一阶段是可以预见的，而且在所有类型的细胞中是一致的。”现在，他几乎可以预见某个细胞类型在重编程过程中，“哪些位点可能被激活，哪些可能被修饰，而哪些将保持沉默，”他同时表示，“我们可以预测这部分。但是，这并不能回答接下来会发生什么”。

第一阶段结束之后，为期一周的停滞阶段让科学家感到非常迷惑。在这一阶段，细胞仍在发生变化，有的还会表达新基因，但这时的细胞行为很难预测，也很难理解。甚至迈斯纳等人观测到H3K4me2修饰，也要在这一阶段较晚的时候，才能增强基因的表达。“大多数细胞会进入部分重编程的状态。有些细胞则更接近重编程状态，我们还不清楚为什么会这样，”迈期纳说，“这是一个 ‘黑匣子’”。然而，如果一个细胞开始合成SOX-2蛋白，就是一个好的迹象。“一旦SOX-2出现，重编程就进入正轨了，”詹尼施说（他研究过细胞近50个基因在重编程过程中的活动）。几天之内，SOX-2蛋白等与多能性有关的转录因子产量就会迅速上升。

但是，这个过程为什么要花费如此长的时间？效率又如此低呢？“我们还不清楚为什么不能更快，”沃尔特詹认为，一个细胞可能需要经过几次分裂，每次至少需要半天，以便改变DNA上的表观遗传标记。“也许，这是限制因素之一”。

关于低转化率，山中伸弥提出了几种可能的解释。一是起始细胞包含各种类型，例如，研究人员采集的、用于提取成纤维细胞的组织，可能混杂了很多互有细微差异的细胞；而即便都是成纤维细胞，彼此也不尽相同，它们的蛋白质和分子也各有差异。此外，在体外培养时，细胞状态也会时常发生变化。这意味着，重编程因子对每个细胞造成的影响都是不同的。“对一部分细胞有效，并不意味着对其他的也有效，”山中伸弥说。此外，细胞的培养基，细胞之间的相互作用都可能存在差异，这就使研究人员难以控制所有变量。“要让细胞之间完全同步是不可能的”。

目前，研究人员试图为完成了重编程的细胞分类，努力完善重编程技术，弄清楚重编程是怎么发生的，从哪一个阶段发生的。沃尔特詹已经发现，4个重编程因子的组合比例，会影响ips细胞的产出。比如，某种比例下，重编程的成功率可能比较高，但最终结果不甚理想，细胞只进入了部分重编程的状态，且状态不稳定；而另一种比例虽然效率较低，得到的iPS细胞的质量却很高。

“宏伟项目”的研究也证明，不同的变量，会产生完全不同的iPS细胞。在纳吉的推动下，“宏伟项目”发起于2010年，来自8个研究机构的30名科学家参加了该项目，目的就是要打开生物学上的这个“黑匣子”。纳吉说：“我想知道那里面有什么。”用山中因子触发重编程后，研究人员在1个月里每天收集1亿个细胞，然后定期分析细胞的蛋白质、RNA、甲基化状态的改变等，然后将分析产生的海量数据分发给世界各地的合作者。纳吉说，该项目的名字就来源于项目规模，“当我们意识到我们已经收集了多少信息之后，就想出了这个名字。毫不夸张的说，这是一项宏伟的事业。”

打开“黑匣子”

最近的一个重要发现是一种新的多能干细胞，称为F级细胞（F-class cell），它们的外观毛茸茸的。研究人员对重编程方法进行微调，就产生了这些细胞：研究人员并没有像之前那样，只在重编程开始后的前几天引入重编程因子，而是持续加入。“这就导致了不同的结果，”纳吉说。

F级细胞与iPS细胞不同，因为前者未能通过最严格的多能性测试之一：注射到小鼠胚胎后，它们不能由此发育成小鼠组织。出于这个原因，一些批评者说，F级细胞可能是其他科学家所说的 “部分重编程”细胞。但纳吉认为，这类细胞没有发育成组织不代表它们没有多能性，因为它们拥有其他多能性特征：例如，它们会形成畸胎瘤，而其中包含多种类型的细胞。

纳吉指出，其他人都忽略了F级状态，因为他们只是在寻找类似于胚胎干细胞的细胞，而他的团队“在多能性这个问题上是无偏见的”。他认为，可能有更多的多能性状态会被发现，而他和同事也会在海量数据中寻找这些状态。“这在概念上是很重要的，它开辟了另一扇大门”。

这些研究，让科学家在重编程的核心问题上争论得越来越激烈：重编程过程是否本身就有随机的、不可预测的因素？直到最近，科学家才达成普遍的共识：重编程确实是随机的。根据该“随机”模式，重编程因子触发分子事件后，一些细胞将进入重编程状态，一些不会——后者的去向无法预测。

但在一些研究，包括汉纳的一项研究都表明，重编程方法可以调整，使这一过程更加高效——这表明随机性可以控制甚至消除。这些研究意味着，重编程可以从一个随机过程转变为确定性的过程。

许多科学家说，现在重编程过程中既有确定性的阶段（开始和结束），也有随机的阶段（中间神秘的一周）。对于这种争论，汉纳轻描淡写，在他看来重编程的随机性和确定性并没有矛盾。他把重编程比作掷硬币：每次掷硬币的结果都是随机的，但掷上100次，人像那面朝上的比例接近50%。类似的，任何一个细胞进入重编程状态都是随机的，但随着时间的推移，重编程技术每次能产生的多能细胞将到达一个确定的百分比 （或许是10%）。扎雷特表示，进一步研究将解决这些争论，弄清楚是什么因素让细胞跳出一周的停滞期。

对于扎雷特而言，关于重编程的争论引出了更重要的问题：引发随机性的生物学规则是什么。“细胞系统本身是构建在一些‘固有噪音’和随机事件之上的，而这些因素会在一定程度上将细胞引向确定的命运方向。细胞的命运并没有因为随机事件而变来变去，”他说。这个问题是涉及细胞类型的基础，这也吸引着他开展研究。

而对于其他人，比如山中伸弥，打开“黑匣子”的目的很实际：更高效的重编程能使实验完成得更好，得到更可靠的细胞来源，最终用于疾病治疗。“我的研究动机是给病人治病，任何有助于推动iPS细胞进入临床的研究都让我感到兴奋。”

（摘自《环球科学》2015年2月号总第110期）