水酶法提取板栗壳棕色素工艺条件的筛选

许 伟，姜慧仙，郑 剑，仲山民，王 超，常银子

（浙江农林大学 农业与食品科学学院，浙江 临安 311300）

水酶法提取板栗壳棕色素工艺条件的筛选

许 伟，姜慧仙，郑 剑，仲山民，王 超，常银子

（浙江农林大学 农业与食品科学学院，浙江 临安 311300）

为了确定水酶法提取板栗壳棕色素的工艺条件，以板栗壳为原料，通过单因素试验和正交试验，对其工艺条件进行筛选。结果表明，水酶法提取板栗壳棕色素的最适工艺条件为：复合酶总酶量2.0%，纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶质量比为2∶3∶5，酶处理pH值5.0，温度50 ℃，时间2.0 h，料液比1∶120。

板栗壳；棕色素；复合酶；工艺条件

板栗Castanea mllissimaBlume属壳斗科Fagaccac栗属坚果类植物，为多年生落叶乔木。板栗在我国分布多达26个省（市、自治区），产量居世界第1位，达到全世界板栗产量的60%以上[1-4]。

现有的文献对板栗壳化学成分以及色素研究的报道较少且不完整。板栗壳棕色素含有苯环及羟基，而不具有典型黄酮类色素结构，色素水溶液对光、热及氧化剂和还原剂的耐受力较强[5]。吴龙云等[6]首次从板栗壳中分离得到2种化合物，分别为4-羟基-3-甲氧基苯甲酸、没食子酸乙酯。鲁晓翔等[7]人从板栗壳中提取多酚类物质。

目前，关于酶法提取板栗壳棕色素的研究尚未有报道。酶法提取过程中植物组织经酶制剂处理后，细胞壁及包裹色素的成分，如蛋白质、淀粉等被分解，使细胞内色素成分充分释放出来，同时具有工艺简单，条件温和，对活性成分破坏小，节约能源，安全环保等特点[8-10]，使得酶法提取已被广泛应用于植物活性成分提取中。水酶法提取色素，应用水作为提取溶剂，经济又方便。因此对水酶法提取板栗壳棕色素的研究具有重要意义。

本试验中通过酶种类的筛选，研究了水酶法从板栗壳中提取棕色素的工艺条件，旨在为利用板栗壳提取植物化学成分提供一定的试验依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验用板栗为浙江主产品种毛板红。

试剂：盐酸、氢氧化钠均为分析纯；纤维素酶、α-淀粉酶、中性蛋白酶、果胶酶（酶活≥30 U/mg，FLUKA）。

仪器：紫外分光光度计（UV-2550，日本岛津公司）；电子天平（AL204，上海电子天平亚津衡器有限公司）；组织捣碎机（A-88，江苏省金坛市医疗仪器厂）；数显pH计（PHS-25，上海精密科学仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DGG-9053AD，上海森信实验仪器有限公司）；数显恒温水浴锅（HH-4，国华电器有限公司）。

1.2 方 法

1.2.1 原料预处理

选择新鲜饱满，大小均匀，无虫蛀、霉烂的优质板栗，生剥壳后，放入50 ℃鼓风烘箱中干燥60 min，粉碎过50目筛，贮存于黑暗阴凉处，待用。

1.2.2 提取工艺流程

称取一定量的板栗壳粉末于锥形瓶中，加入一定体积蒸馏水，在50 ℃水浴中浸提1.0 h。再用1.0%的NaOH和1.0%的HCl调节溶液的pH值，并加入预先设计好的酶的种类与剂量，在水浴中酶解一定时间。将酶解后的提取物放置在80 ℃水浴中灭酶10 min。再加入蒸馏水进行提取，调节pH至9.0，在80 ℃水浴中浸提2.0 h。室温冷却后，滤液直接过滤进行定容。

1.2.3 吸收峰的测定

在未加酶情况下，进行上述试验，找特征性最大吸收波长。

1.2.4 吸光值的测定

预测定容后的色素提取液吸光值，通过稀释将其控制在0.500～1.000的范围内。本试验参照文献[10]～[11]进行，每组试验平行3次，取平均值作图分析。

1.2.5 吸收波长的测定

称取0.5 g板栗壳粉末于250 mL锥形瓶中，在50 ℃、pH值9.0、料液比1∶200的条件下浸提2.0 h，过滤后定容，进行板栗壳棕色素吸收波长的测定，确定其最大吸收波长。

图1 板栗壳棕色素水溶液吸收光谱Fig. 1 The absorption spectrum of aqueous solution of brown pigment from chestnut shell

图2 没食子酸水溶液吸收光谱Fig. 2 The absorption spectrum of aqueous solution of gallic acid

2 结果与分析

2.1 板栗壳棕色素的紫外光谱分析

板栗壳棕色素水溶液和没食子酸水溶液的吸收光谱分布见图1和图2。由图1可见，板栗壳棕色素水溶液在205 nm附近有个较强的吸收峰，在274 nm附近有1个中等强度的吸收峰，这与图2中没食子酸水溶液吸收光谱相近，没食子酸水溶液在219 nm附近有个较强的吸收峰，在266 nm附近有1个中等强度的吸收峰。由吴龙云等[6,12]的研究可知，板栗壳棕色素中含有没食子酸，而由蓝海等[13-15]关于没食子酸提取的研究中，分别采用273、271、267 nm的测定波长可推断，板栗壳棕色素水溶液光谱图中的中等强度吸收峰可以作为板栗壳棕色素水溶液的特征吸收峰，用于试验测定。因此，本次试验中确定测定波长为274 nm。

2.2 酶提取工艺试验

2.2.1 酶种类的确定

本次试验选用纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶。酶种类对吸光值的影响如图3所示。由图3可见，纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶对吸光值均有不同程度的影响，而对吸光值影响较大的酶有纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶。因此，本次试验选用纤维素酶、中性蛋白酶和果胶酶进行酶的复合试验。

2.2.2 最适单酶酶量的确定

单酶酶量对吸光值的影响如图4所示。由图4可见，添加纤维素酶、中性蛋白酶及果胶酶在一定程度上均可增加板栗壳棕色素水溶液的吸光值。对于中性蛋白酶和果胶酶，其酶量在0～1 200 U/g（每克板栗壳干粉对应的酶活力单位数）范围，随着酶量的增加，吸光值呈上升趋势，当酶量大于1 200 U/g后，吸光值曲线逐渐趋于水平；而纤维素酶的酶量在800 U/g时方使吸光值达最高。因此，确定纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶各自的最适酶添加量分别为 800、1 200、2 000 U/g。

图 3 酶种类对吸光值的影响Fig. 3 Effect of enzyme kind on light absorbance value

图4 单酶酶量对吸光值的影响Fig. 4 Effect of single enzyme amount on light absorbancevalue

2.2.3 复合酶配比正交试验

（1）正交试验因素和水平的选取

植物细胞壁组成复杂，单一酶酶解的效果有限，多酶的复合作用会具有更明显的效果。因此，为了进一步探讨复合酶的作用效果，本次试验中根据单酶酶量的单因素试验结果，进行L4(23)的正交试验，以确定最适复合酶配比。正交试验中因素及水平的选取见表1。

表 1 复合酶配比正交试验的因素和水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment result of composite enzyme proportion U/g

（2）正交试验结果与分析

正交试验结果见表2，其极差分析结果见表3。

表 2 复合酶配比正交试验的结果Table 2 The results of the orthogonal experiment of composite enzyme proportion

表 3 复合酶配比正交试验结果的极差分析Table 3 Range analysis of the orthogonal experiment result of composite enzyme proportion

根据表3中极差分析结果可以看出：本次试验中选用的3种酶对板栗壳棕色素提取率的影响由高到低依次为：纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶，即B＞A＞C。

复合酶配比正交试验结果的方差分析和多重比较结果分别见表4和表5。由表4中方差分析结果可以看出：中性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶对色素提取率均有极显著影响（P＜0.01），并且与极差分析结果一致。结合方差分析结果和极差分析结果，本次试验中选取处理1作为最适复合酶配比试验结果。最适配比为B1A1C1，即纤维素酶、中性蛋白酶、果胶酶质量比为2∶3∶5。

2.3 复合酶酶解工艺试验

2.3.1 最适总酶量的确定

最适总酶量筛选试验结果如图5所示。总酶量在0.5%～2.0%范围内，吸光值随复合酶总酶量的增大而增大，大于2.0%时，吸光值曲线逐渐趋于水平。在酶促反应中，酶浓度越高反应速度越快，但过高速度增加反而不明显，综合考虑酶制剂成本，选择2.0%的总酶量。

表 4 复合酶配比正交试验结果的方差分析Table 4 Variance analysis of the orthogonal experiment result of composite enzyme proportion

表 5 复合酶配比正交试验结果的多重比较†Table 5 Multiple compares of the orthogonal experiment result of composite enzyme proportion

图 5 复合酶总酶量对吸光值的影响Fig. 5 Effect of total composite enzyme amount on light absorbance value

2.3.2 最适酶解pH值的确定

最适酶解pH值筛选试验结果如图6所示。在pH值3.5～4.5的范围内，吸光值随着pH值的增加而增大；在pH值4.5～5.5的范围内，吸光值逐渐减小；在pH值5.5之后，吸光值反而呈递增趋势。在pH值5.5之前的变化主要由于酶受pH值的影响所致，在pH值4.5时，复合酶达到最适pH值。

图 6 酶解pH值对吸光值的影响Fig. 6 Effect of enzymolysis pH value on light absorbance value

2.3.3 最适酶解温度的确定

最适酶解温度筛选试验结果如图7所示。在反应的初始阶段，随着温度的升高吸光值在增大，但超过50 ℃，吸光值反而下降。低于50 ℃，酶活不能充分发挥，酶反应速度过低导致色素不能充分溶出，在此温度范围内，温度升高可提高反应速度。超过此温度酶逐渐失活，减少了参与反应的分子数，反应速度逐渐降低。由此确定复合酶最适反应温度为50 ℃。

图 7 酶解温度对吸光值的影响Fig. 7 Effect of enzymolysis temperature on light absorbance value

2.3.4 最适酶解时间的确定

最适酶解时间筛选试验结果如图8所示。在反应初期2.0 h内，由于底物浓度最大，酶与底物充分结合，酶的作用位点也最多，反应随时间延长，吸光值增大较明显。超过2.0 h，随着酶解的继续进行，底物浓度逐渐减少，反应位点也相应减少，酶解产物浓度增加，对酶促反应起到反馈抑制作用，反应达平衡时，吸光值趋于平缓。综合考虑经济效益与时间效率等因素，酶解时间确定为2.0 h。

2.3.5 复合酶酶解条件正交试验

根据复合酶酶解单因素试验结果，在一定条件下，总酶量、酶解pH值、温度和时间，对色素的提取均有显著的影响，为了进一步探讨，选择酶解pH值、温度、时间这3个因素进行L9(33)的正交试验，以确定最佳酶解工艺条件。

（1）正交试验因素和水平的选取

复合酶酶解条件筛选正交试验的因素和水平见表6。

图 8 酶解时间对吸光值的影响Fig. 8 Effect of enzymolysis time on light absorbancevalue

表 6 复合酶酶解条件筛选正交试验的因素和水平Table 6 Factors and levels of the orthogonal experiment of enzymolysis conditions screening of composite enzyme

（2）正交试验结果和分析

复合酶酶解条件筛选的正交试验结果见表7，极差分析、方差分析、多重比较分析结果分别见表 8～ 10。

表 7 复合酶酶解条件筛选的正交试验结果Table 7 The result of the orthogonal experiment of enzymolysis conditions screening of composite enzyme

表 8 复合酶酶解条件筛选正交试验结果的极差分析Table 8 Range analysis of the orthogonal experiment result of enzymolysis conditions screening of composite enzyme

表 9 复合酶酶解条件筛选正交试验结果的方差分析Table 9 Variance analysis of the orthogonal experiment result of enzymolysis conditions screening of composite enzyme

根据表8中极差分析结果可以看出：影响板栗壳棕色素提取率的因素的主次顺序依次为：时间、温度、pH值，即B＞A＞C。

从表9中的方差分析结果可以看出：从色素提取液的吸光值来看，酶解温度、时间、pH值对色素的提取率均有极显著的影响（P＜0.01），并且与极差分析结果一致。

根据表10中因素的各个处理间差异显著性检验结果，结合方差分析和极差分析结果，并考虑成本等因素，本次正交试验的最佳工艺组合应做如下选取：时间（B）取2.0 h（B2），温度（A）取50 ℃（A2），pH值（C）取5.0（C3）。由此，水酶法提取板栗壳棕色素的最佳组合为B2A2C3，即酶解时间2.0 h，温度50 ℃，pH值5.0。

表 10 复合酶酶解条件筛选正交试验结果的多重比较Table 10 Multiple compares of the orthogonal experiment result of enzymolysis conditions screening of composite enzyme

2.3.6 料液比的确定

料液比对吸光值的影响如图9所示。由图9可以看出，料液比值大时，底物浓度过高，但溶剂溶解能力有限，因此料液比在1∶(80～120)范围内，色素水溶液吸光值逐渐增加；料液比值小时，底物浓度过低，色素含量有限，色素反而被稀释，在1∶120之后，色素水溶液吸光值减小。因此选取1∶120料液比。

图 9 料液比对吸光值的影响Fig. 9 Effect of solid-liquid ratio on light absorbance value

3 小 结

本试验中对水酶法提取板栗壳棕色素的工艺条件进行了研究，通过选酶试验、单酶酶量单因素试验和复合酶配比正交试验，确定酶制剂种类为纤维素酶＋中性蛋白酶＋果胶酶复合酶制剂（质量比为2∶3∶5）；又对复合酶总酶量、酶解pH值、温度、时间和料液比等工艺条件进行了筛选，并通过正交试验确定了从水酶法提取板栗壳棕色素的方案，得出了最适工艺条件。最适工艺条件为：复合酶总酶量2.0%，酶处理pH值5.0，温度50 ℃，时间2.0 h，料液比1∶120。

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Screening of extraction process conditions of brown pigment from chestnut shell by enzymatic hydrolysis method

XU Wei, JIANG Hui-xian, ZHENG Jian, ZHONG Shan-min, WANG Chao, CHANG Yin-zi
(School of Agriculture and Food Science, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Lin’an 311300, Zhejiang, China)

In order to obtain the optimal extraction process conditions of brown pigment from chestnut shell by enzymatic hydrolysis method, taking chestnut shell as materials, the process conditions were screened by several single factor experiments and a orthogonal experiment. The results showed that the optimal extraction process conditions were 2.0% composite enzymes, the mass ratio 2∶3∶5 of cellulose, neutral protease and pectinase, reaction pH value 5.0,temperature 50 ℃ , duration 2.0 h, and solid-liquid ratio 1 ∶ 120.

chestnut shell; brown pigment; composite enzymes; process conditions

S664.2

A

1003—8981(2015)02—0101—06

2014-12-20

浙江农林大学科研启动发展基金项目“板栗壳天然色素精制与应用特性研究”（2008FR053）；木本粮油产业科技创新团队项目“油茶饼粕中茶籽多糖的提取与纯化研究”（2011R50030-2）；浙江省自然科学基金项目（Y3110450）。

许 伟，硕士研究生。

郑 剑，讲师，硕士。E-mail：zhengjian622@126.com

许 伟,姜慧仙,郑 剑,等.水酶法提取板栗壳棕色素工艺条件的筛选[J].经济林研究,2015,33(2):101－106.

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.02.018

http: //qks.csuft.edu.cn

[本文编校：闻 丽]