两性多肽结构影响鲍曼不动杆菌外膜通透性的实验研究

张 劼，陈 永，曾 颖△,李秀娟

(1.重庆市第三人民医院老年病科 400014;2.重庆医科大学附属第一医院第一分院内科 400015)

两性多肽结构影响鲍曼不动杆菌外膜通透性的实验研究

张 劼1，陈 永1，曾 颖1△,李秀娟2

(1.重庆市第三人民医院老年病科 400014;2.重庆医科大学附属第一医院第一分院内科 400015)

目的 明确两性多肽结构对鲍曼不动杆菌(AB)外膜通透性的影响。方法PCR扩增LysAB3基因及删除两性多肽结构的LysAB3-D基因，以pET28a(+)为载体构建重组质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达LysAB3及LysAB3-D，金属离子螯合亲和层析法纯化重组蛋白。将AB分别经LysAB3及LysAB3-D处理后，用扫描电子显微镜观察菌体形态，荧光显微镜观察菌体中是否有绿色荧光的聚集。结果经LysAB3处理后的AB，在扫描电子显微镜下可见菌体表面粗糙、皱缩，部分裂解为碎片；在荧光显微镜下可见菌体内有绿色荧光聚集。而删除两性多肽结构的LysAB3-D作用AB后，却没有上述现象的发生。结论两性多肽结构可增加AB外膜通透性，有助于裂解酶进入其中，达到抗菌目的。

噬菌体；裂解酶；两性多肽结构；鲍曼不动杆菌；外膜通透性

2010年中国CHINET细菌耐药监测网的数据表明，鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii,AB)菌株临床分离率已经达到革兰阴性菌总体分离率的第3位，其耐药率急剧上升，甚至到了无药可治的地步[1]。噬菌体是一类细菌依赖性病毒，能在菌体内快速增殖并最终裂解细菌达到抗菌作用，但噬菌体往往只能裂解单一的细菌分离株，而不能裂解同一类细菌的其他分离株。来源于噬菌体的裂解酶则不需要特异性的识别过程，可裂解不同的细菌分离株，其裂菌谱相比噬菌体明显增宽。当前裂解酶应用于革兰阴性菌感染的研究很少，这是因为革兰阴性菌外膜通透性低，限制了裂解酶进入其中裂解细菌[2]。但有研究指出[3]，部分裂解酶C端的两性多肽结构，可增加革兰阴性菌外膜的通透性，形成细菌外膜孔道，有利于裂解酶进入其中裂解细菌。本文主要对上述观点进行实验验证。

1 材料与方法

1.1菌株、噬菌体及试剂 AB菌株来自重庆巿临床检验中心；噬菌体AB3由前期分离纯化；正反向引物(上海生工生物工程公司)；Nco I、Xho I、dNTP、Kod plus DNA聚合酶、T4 DNA连接酶(大连宝生物工程公司)；咪唑、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-Thiogalacto pyranoside,IPTG)、卡那霉素、LB培养基、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)(美国Sigma公司)；Ni2+-NTA亲和层析柱(美国GE公司)；pET28a(+)质粒(美国Novagen公司)。

1.2LysAB3基因的表达及纯化 将前期分离纯化的噬菌体AB3 DNA作为模板，设计目的基因LysAB3的正反向引物，加入限制性内切酶Nco I和Xho I的酶切位点。加入dNTP及Kod plus DNA聚合酶进行PCR反应，使用回收试剂盒分离纯化PCR产物，使用限制性内切酶Nco I和Xho I分别酶切上述PCR产物和质粒pET28a(+)，加入T4 DNA连接酶行连接反应，构建重组质粒pET28a-LysAB3，筛选阳性克隆测定目的基因序列。将pET28a-LysAB3转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，接种于LB培养液(含卡那霉素50 μg/mL)，37 ℃振荡过夜培养至OD600=0.6，加IPTG诱导表达，离心收集菌体，超声破碎4 ℃离心，上清液用Ni2+-NTA 亲和层析柱分离纯化，经咪唑洗涤、洗脱后，收集重组蛋白，取样检测，将重组蛋白命名为LysAB3[4]。

1.3删除两性多肽结构的LysAB3-D基因的表达及纯化 将前期分离纯化的噬菌体AB3 DNA作为模板，设计正反向引物，加入限制性内切酶Nco I和Xho I的酶切位点。扩增LysAB3基因序列前端的354 bp，加入dNTP及Kodplus DNA聚合酶行PCR反应，使用回收试剂盒分离纯化PCR产物，使用限制性内切酶Nco I和Xho I分别酶切PCR产物和质粒pET28a(+)，T4 DNA连接酶进行连接反应，构建重组质粒pET28a-LysAB3-D，筛选出阳性克隆，检测重组质粒目的基因序列。将pET28a-LysAB3-D转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，接种于LB培养液(含卡那霉素50 μg/mL)，37 ℃振荡过夜培养至OD600=0.6，加IPTG诱导表达，超声破碎4 ℃离心，上清液用Ni2+-NTA亲和层析柱分离纯化，经咪唑洗涤、洗脱后，收集重组蛋白，取样检测，将重组蛋白命名为LysAB3-D。

1.4扫描电子显微镜下观察AB菌体形态 AB分别与LysAB3、LysAB3-D各50 μg混合培养37 ℃ 30 min后，经固定、脱水、干燥和真空镀膜制样后，扫描电子显微镜(Hitachi S-3 000 N)下观察，并设阴性对照。

1.5AB外膜通透性检测 采用FITC荧光染色的方法观察AB外膜通透性的改变。按Mangoni等[5]所描述的方法，将AB于37 ℃的LB培养液振荡过夜，直至OD600=0.6，之后将细菌离心、洗涤并重悬于PBS缓冲液中。将107细菌分别混合50 μg的LysAB3和LysAB3-D，用PBS稀释至100 μL，设立阴性对照组。将上述混合物置于EP管37 ℃共育30 min后，倾倒于玻片上，37 ℃静置30 min，保证AB附着于玻片上。用PBS液轻轻冲洗玻片后，滴加1 mL FITC溶液(6 μg/mL)。静置30 min后，用PBS液轻轻冲洗玻片，去除未附着FITC。随后分别用普通白光显微镜和荧光显微镜观察玻片，了解绿色荧光探针FITC是否能进入菌体内。

2 结 果

2.1LysAB3基因的表达及纯化 扩增产物经过Nco I和Xho I双酶切后，得到pET28a-LysAB3载体，筛选阳性克隆抽提质粒并测序，测序结果与GenBank KC311669中的裂解酶基因相同，构建成功[6]。将pET28a-LysAB3转化后，经IPTG诱导表达，收集菌体超声破碎，取上清液用Ni2+-NTA亲和层析柱分离纯化。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示重组蛋白与预期蛋白相对分子质量21.07×103基本一致(图1)。

图1 LysAB3重组蛋白表达的SDS-PAGE分析

2.2删除两性多肽结构的LysAB3-D基因的表达及纯化 扩增产物经Nco I和Xho I双酶切后，得到重组质粒pET28a-LysAB3-D，转化后筛选阳性克隆抽提质粒测序，比对后证明同源性100%。将pET28a-LysAB3-D转化后诱导表达收集菌体超声破碎，取上清液用Ni2+-NTA亲和层析柱分离纯化[7]。SDS-PAGE显示重组蛋白与预期蛋白相对分子质量14.6×103基本一致，将重组蛋白命名为LysAB3-D(图2)。

图2 LysAB3-D重组蛋白表达的SDS-PAGE分析

2.3扫描电子显微镜下观察AB菌体形态 经LysAB3处理后的AB菌体表面粗糙、皱缩、肿胀、碎片形成，原有形态改变(图3A)；而LysAB3-D处理后及对照组的AB菌体表面光滑、形态规则，呈杆状(图3B、C)。表明LysAB3对AB有裂解活性，而删除了两性多肽结构的LysAB3-D则丧失了抗菌作用，提示这种两性多肽结构在抗菌过程中可能起到重要作用。

A:LysAB3处理后；B:LysAB3-D处理后；C:阴性对照。

图3 扫描电子显微镜下AB菌体形态(×10 000)

A:LysAB3-D处理后普通白光显微镜；B:LysAB3-D处理后荧光显微镜；C:LysAB3处理后普通白光显微镜；D:LysAB3处理后荧光显微镜。

图4 荧光显微镜下细菌细胞外膜通透性的改变(×400)

2.4荧光显微镜下观察AB外膜通透性 FITC是一种小分子量(389.4 Da)绿色荧光探针，不能通过细菌细胞膜。本研究发现，FITC不能进入LysAB3-D(删除两性多肽结构)处理过的AB菌体，荧光显微镜不能在菌体中发现绿色荧光的聚集(图4A、B)；但FITC却能进入LysAB3处理过的AB菌体，通过荧光显微镜可见绿色荧光在菌体内的聚集(图4C、D)。提示裂解酶LysAB3的两性多肽结构可增加细菌外膜通透性，有助于FITC进入其中[8]。

3 讨 论

噬菌体治疗细菌感染时需要与宿主菌发生特异性吸附并注入其DNA，导致噬菌体抗菌谱的专一性太强，大大限制了噬菌体的应用[2]。而裂解酶是噬菌体基因组复制晚期合成的一种酶，它能降解细菌细胞壁的肽聚糖结构，从而裂解细菌菌体，是一种新型杀菌物质。虽然裂解酶应用于革兰阳性菌治疗方面的研究较多，但应用于革兰阴性菌感染方面的研究却很少。其原因为革兰阴性菌外膜的主要成分——脂多糖不允许大分子量物质通过，仅允许小分子量疏水性物质通过。

而噬菌体AB3来源的裂解酶LysAB3 C端(113～145 aa)聚集的氨基酸往往带有较多正电荷，如赖氨酸、精氨酸，周围还被疏水氨基酸所包绕，构成了包含碱性氨基酸残基的螺旋状两性多肽结构。借助这种螺旋状两性多肽结构，LysAB3的C端可明显增加革兰阴性菌外膜的通透性。究其原因可能与细菌外膜形成离子孔道有关，LysAB3的C端可竞争性地替代革兰阴性菌外膜中，发挥连接作用的Mg2+或Ca2+，并中和脂多糖，破坏了细菌外膜的密闭性，增加了通透性[3]。LysAB3通过细菌外膜进入菌体后，可水解细胞壁肽聚糖共价键，破坏菌体的完整性、裂解细菌，达到抗菌治疗目的。有研究指出，缺少C端的T4裂解酶，不能通过细菌外膜，提示裂解酶C端的两性多肽结构可能在增加细菌外膜通透性方面起到重要作用[9-10]。Lai等[3]构建的裂解酶缺少两性多肽结构，仅保留了酶解催化区域，使裂解酶丧失了对细菌外膜的通透性，抗菌率下降至原水平的40%；若进一步去除酶解催化区域，抗菌率可进一步下降至原水平的20%，提示两性多肽结构在裂解酶杀菌过程中起到了重要作用。

本研究发现经LysAB3处理后的AB，菌体部分裂解为碎片，残存菌体表面粗糙、皱缩、肿胀，原有形态改变，而删除两性多肽结构的LysAB3-D处理后的AB却未见上述现象。另一方面，经LysAB3处理后的AB外膜通透性增加，导致原本不能通过细胞膜的FITC进入其中，菌体内可见绿色荧光的聚集。而删除两性多肽结构的LysAB3-D处理后的AB菌体中却未见有绿色荧光的聚集，提示裂解酶的两性多肽结构增加了细菌外膜通透性，削弱了菌体的密封性，不仅导致裂解酶进入其中降解肽聚糖，还可导致菌体内重要物质如DNA的丢失、渗透压的改变，最终导致细菌的裂解。下一步的研究将重组和表达这种两性多肽结构的蛋白质，如果将其与抗菌药物联用，可成为一种“helper agent”[11]，来增加细菌外膜的通透性，有利于抗菌药物进入其中发挥作用，提高抗菌药物的杀菌能力。甚至还可找到一个两性多肽结构蛋白使用的恰当浓度，既可增加细菌外膜通透性，又不会彻底破坏细菌外膜的完整性，从而减少菌体裂解所导致的内毒素释放，而这正是裂解酶应用于抗菌治疗中所存在的最大问题[12]。

裂解酶LysAB3通过其C端的两性多肽结构来增加AB外膜的通透性，辅助具有酶解催化域的N端降解肽聚糖共价键，导致细菌裂解，达到抗菌目的[13]。在下一步的研究中，可通过重组和表达这种两性多肽结构蛋白来增加细菌外膜的通透性，从而提高抗菌药物的效力，减少耐药率的发生[14-15]。

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Effects of the amphiphilic peptides on membrane permeability of Acinetobacter baumannii*

ZhangJie1,ChenYong1,ZengYing1△,LiXiujuan2

(1.DepartmentofGeriatricsMedicine,theThirdPeople′sHospitalofChongqing,Chongqing400014,China;2.DepartmentofInternalMedicine,theFirstBranch,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400015,China)

Objective To investigate effects of the amphiphilic peptides on membrane permeability of acinetobacter baumannii.Methods The LysAB3 and LysAB3-D (lack of amphiphilic peptides structure gene) was synthesized and inserted into the vector pET28a(+) to construct the recombinant expression plasmid (pET28a-LysAB3,pET28a-LysAB3-D).After expression in E.coli BL21(DE3) and purification with Ni2+-NTA Sepharose.Acinetobacter baumannii was observed by scanning electron microscopy and fluorescence microscope,pretreated with LysAB3 and LysAB3-D respectively.Results Under scanning electron microscopy,LysAB3-treated acinetobacter baumannii exhibited not only significant abnormalities,including deep roughening of the cell surface,but also FITC readily accumulated in bacteria.It was different from LysAB3-D-treated.Conclusion These results indicate that the amphiphilic peptides structure increase membrane permeability of acinetobacter baumannii,which helps LysAB3 degrade bacteria.

bacteriophage;endolysin;amphiphilic peptides;Acinetobacter baumannii;membrane permeability

·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.09.003

重庆市卫计委科研基金资助项目(2013-2-097)；重庆市渝中区科技计划基金资助项目(20130149)。

张劼(1978-)，副主任医师，博士，主要从事临床呼吸研究。

△通讯作者,Tel：13996306381；E-mail:775899006@qq.com。

Q939

A

1671-8348(2015)09-1162-03

2014-10-09

2014-12-03)