BRCA1基因在散发性乳腺癌中的表达及异常甲基化

韦 薇，李秋云，唐 玮，蒋 奕，姬逸男，杨华伟，刘剑仑

(广西医科大学附属肿瘤医院乳腺外科，南宁 530021)

BRCA1基因在散发性乳腺癌中的表达及异常甲基化

韦 薇，李秋云，唐 玮，蒋 奕，姬逸男，杨华伟，刘剑仑△

(广西医科大学附属肿瘤医院乳腺外科，南宁 530021)

目的 通过检测乳腺癌易感基因1(BRCA1)基因在散发性乳腺癌中的表达情况及其启动子甲基化状态，探讨BRCA1基因与散发性乳腺癌的关系。方法应用实时荧光定量PCR的方法和免疫组织化学方法分别检测BRCA1 mRNA和蛋白在60例散发性乳腺癌组织、癌旁正常乳腺组织及30例乳腺良性病变组织中的表达情况；应用重亚硫酸盐测序PCR(BPS)联合TA克隆测序方法检测上述组织中BRCA1启动子CpG岛的甲基化状态，分析BRCA1基因表达和启动子甲基化相关性。结果BRCA1 mRNA和蛋白在散发性乳腺癌组织中的相对表达水平分别低于癌旁正常组织及乳腺良性病变组织，差异有统计学意义(P<0.001)。乳腺癌组织中BRCA1蛋白的表达率为51.7%(31/60)，明显低于癌旁正常乳腺组织的71.7%(43/60)及乳腺良性病变组织的66.7%(20/30)，差异有统计学意义(P<0.001)；散发性乳腺癌组织中BRCA1启动子甲基化率为31.7%(19/60)，癌旁正常乳腺组织及乳腺良性病变组织均未检测出甲基化，差异有统计学意义(P=0.000)；BRCA1蛋白表达与其启动子甲基化呈负相关(r=-0.345，P=0.007)。结论乳腺癌易感基因BRCA1启动子区CpG岛甲基化导致BRCA1基因表达显著下调，可能参与散发性乳腺癌的发生、发展。

乳腺肿瘤；BRCA1；基因；甲基化

乳腺癌易感基因1(breast cancer susceptibility gene 1，BRCA1)是最早发现的与家族遗传性乳腺癌发生关系密切的抑癌基因[1]。有文献报道，大约45%的家族性乳腺癌和90%的遗传性乳腺癌中可以检测出BRCA1基因的突变[2-3]。而在散发性乳腺癌中很少发现BRCA1的突变。但约有30%～40%的散发性乳腺癌中BRCA1 mRNA和蛋白表达降低或缺失[4]，表明BRCA1也是参与散发性乳腺癌发生、发展的重要基因。目前，BRCA1在散发性乳腺癌中的具体功能和作用机制尚不清楚，本研究拟从BRCA1基因表达和甲基化2个方面研究散发性乳腺癌与BRCA1基因的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集广西医科大学附属肿瘤医院乳腺外科2010年9月至2012年12月乳腺手术切除标本，包括60例散发性乳腺癌组织及配对的距癌组织阴性切缘5 cm以上的正常乳腺组织。乳腺良性病变30例，其中，乳腺纤维瘤20例，乳腺囊性增生症10例，患者均为女性。乳腺癌患者年龄31～76岁，平均50.3岁。乳腺良性病变患者年龄18～42岁，中位年龄31岁。所有患者均无乳腺癌家族史，术前未接受化疗、放疗和其他抗肿瘤治疗。术后所有标本均经病理科医师确诊。本实验经医院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2标本处理 术中取材后一部分标本予生理盐水冲洗后立即放入液氮中，然后置于-80 ℃冰箱中冻存。另一部分标本予中性甲醛溶液固定24 h，石蜡包埋保存。

1.3实时荧光定量PCR检测LOX mRNA Trizol法提取各组细胞总RNA，取2 μg总RNA逆转录合成cDNA。引物序列：BRCA1 Forward:TGT GAG GCA CCT GTG GTG AC，Reverse:GTG GCT GGC TGC AGT CAG TAG(125 bp)；β-actin Forward：AGT TGC GTT ACA CCC TTT CTT G，Reverse：CAC CTT CAC CGT TCC AGT TTT(148 bp)。实时荧光定量PCR按Quant SYBR Green PCR试剂盒说明书操作，实时荧光定量基因扩增仪上扩增。反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，40个循环。读取Ct值，按公式“△CT=CT平均值(BRCA1)-CT平均值(β-actin)”分别计算各组的△CT，用2-△CT代表BRCA1 mRNA的表达量。

1.4免疫组织化学染色 石蜡包埋组织，以5 μm连续切片，免疫组织化学染色SP法操作步骤按说明书进行。用已知阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。BRCA1染色以细胞核和(或)细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性，无着色为阴性细胞。每批染色的阳性对照片应显示为阳性、阴性对照片应显示为阴性，否则整批切片重染。

1.5免疫组织化学染色结果分析 (1)定性分析：每张切片随机选择5个200倍镜视野。计算阳性细胞率=(阳性细胞数/计数肿瘤细胞总数)×100%。以阳性细胞大于或等于10%为阳性，小于10%为阴性[5]。(2)定量分析：每张切片随机选取5个200倍视野，用Image Pro Plus 6.0软件测得每个视野阳性表达区域面积(area SUM)和累计光密度(IOD SUM)值，通过IOD SUM/area SUM计算平均光密度(IOD AVE)，取5个视野光密度平均值代表该切片BRCA1蛋白的表达量。

1.6重亚硫酸盐测序PCR(BSP)检测BRCA1基因启动子甲基化状态 应用ABI公司的Methyl Primer Express v1.0软件对BRCA1 mRNA转录体转录起始位点上游-2 000 bp和下游+1 000 bp进行CpG岛分析，发现存在2个CpG岛，分别为长度244 bp(-1 279 bp～-1 036 bp)和长度221 bp (-937 bp～-717 bp)，以-937 bp～-717 bp为检测目标，测序分析甲基化情况。采用Methprimer针对CpG 岛设计BSP引物，引物序列如下。上游引物:5′-GAT TGG GTG GTT AAT TTA GAG T-3′；下游引物：5′-AAT TAT CTA AAA AAC CCC ACA A-3′，扩增产物长度为234 bp。按DNA提取试剂盒说明书提取乳腺癌、癌旁乳腺组织及乳腺良性肿瘤组织中的DNA，用Invitrogen的MethylCodeTMBisulfite Conversion Kit对样本基因组DNA进行处理。BSP总反应体系为25 μL，其中，上、下游引物各为0.5 μL，甲基化修饰后的DNA为1.0 μL，反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环35个周期后，最后72 ℃延伸5 min结束。产物经凝胶电泳后回收纯化，与TA载体链接，转化至DH5A感受态细胞后，挑选5个阳性克隆测序，测序结果采用BiQ Analyzer软件分析。

2 结 果

2.1乳腺组织中BRCA1 mRNA表达水平的检测 实时荧光定量PCR结果显示，乳腺癌组织、癌旁正常乳腺组织及乳腺良性病变组织中BRCA1 mRNA的相对表达水平为(0.14±0.06)、(0.31±0.12)和(0.29±0.09)，BRCA1 mRNA在散发性乳腺癌组织中的表达明显低于癌旁组织及乳腺良性病变组织(P<0.05)，而乳腺良性病变组织与癌旁组织间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2乳腺组织中BRCA1蛋白表达水平的检测 BRCA1蛋白主要分布在细胞核，少数出现在细胞质(图1)。60例乳腺癌组织中BRCA1蛋白的表达率为51.7%(31/60)，明显低于癌旁正常乳腺组织的71.7%(43/60)及乳腺良性病变组织的66.7%(20/30)。根据Image Pro Plus6.0软件测得，BRCA1蛋白在乳腺癌组织、癌旁组织及乳腺良性病变组织中的平均光密度值分别为(0.237±0.084)、(0.762±0.255)和(0.684±0.272)。乳腺癌组织中BRCA1蛋白表达率及表达量明显低于癌旁正乳腺组织及乳腺良性病变组织(P<0.05)，后两者间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

A:BRCA1阳性表达;B:BRCA1阴性表达。

图1 免疫组织化学染色检测BRCA1蛋白在乳腺癌组织中的表达情况(SP，×400)

2.3乳腺组织中BRCA1甲基化的检测 对乳腺癌和癌旁正常组织及乳腺良性病变组织中的BRCA1基因5′调控序列-937 bp～-717 bp区段内的CpG位点甲基化状态的BSP测序分析，结果显示乳腺癌组织中BRCA1启动子甲基化率为31.7%(19/60)，而在癌旁正常乳腺组织及乳腺良性病变组织均未检测出BRAC1启动子甲基化，差异有统计学意义(P=0.000)。见图2。

●：发生甲基化的CG位点；○：未发生甲基化的CG位点。

图2 BSP方法检测3种乳腺组织中BRCA1基因启动子区甲基化黑白点图

2.4乳腺癌组织中BRCA1蛋白表达与启动子甲基化相关性 60例乳腺癌组织中有31例BRCA1蛋白阳性表达，其中启动子甲基化的为5例，而29例BRCA1阴性表达的乳腺癌组织中BRCA1基因的甲基化的为14例。用Spearman相关分析，BRCA1蛋白表达与甲基化之间为负相关(r=-0.345，P=0.007)，证明BRCA1基因启动子的甲基化与其转录和翻译水平呈负相关。

3 讨 论

与其他肿瘤抑制基因一样，BRCA1参与了许多重要的细胞进程，它能防止细胞失去控制地生长和分化，在调节细胞进程、DNA损伤修复、细胞生长与凋亡及转录活化和抑制多种生物学途径中发挥重要作用[6-7]。BRCA1功能的缺陷，可能会导致基因组不稳定性，从而增加肿瘤发生的风险[8]。BRCA1基因突变在家族性乳腺癌中的作用已得到广泛认同，而在散发性乳腺癌中BRCA1基因的突变非常罕见，但有研究发现在散发性乳腺癌中BRCA1 mRNA和蛋白表达水平的下降或缺失。这些结果表明，有突变之外的其他机制参与了散发性乳腺癌中BRCA1基因在转录水平和(或)转录后水平的抑制。

近年来研究发现DNA启动子甲基化模式的改变，尤其是某些抑癌基因局部甲基化水平的异常增高，在肿瘤的发生和发展的过程中起到了不容忽视的作用[9]。启动子异常甲基化是肿瘤发生的早期事件，主要发生在启动子CpG岛内5′-端胞嘧啶碱基上，这些位点在正常情况下处于未甲基化状态。发生异常甲基化往往会改变基因的表达模式，导致抑癌基因的转录抑制或沉默，失活的抑癌基因不能负调控细胞周期增殖，从而导致细胞恶性改变[10]。P16、NOEY2、TIMP3、RASSF1A等基因是目前已经得到证实的发生DNA甲基化的乳腺癌相关基因[11-13]。

乳腺癌易感基因BRCA1启动子甲基化近年来在散发性乳腺癌中也受到广泛关注。Rice等[14]检测6个散发性乳腺癌细胞系的BRCA1启动子的甲基化水平及mRNA表达水平，发现有1个细胞系的BRCA1的CpG位点60%以上发生甲基化，其mRNA表达水平仅为正常乳腺上皮细胞水平的1/8。其他5个细胞系的BRCA1 mRNA表达也有不同程度的下降，但均未检测到甲基化。说明BRCA1 mRNA的表达水平与乳腺癌发生有关，mRNA表达水平可能受启动子甲基化水平调控。本研究检测了60例散发性乳腺癌组织、与之配对癌旁组织以及30例乳腺良性病变组织中BRCA1基因表达水平及启动子甲基化情况。结果显示BRCA1 mRNA和蛋白在乳腺癌组织中表达水平明显低于癌旁组织及乳腺良性病变组织。这表明乳腺癌中BRCA1基因在转录水平发生了下调。根据亚硫酸盐测序结果显示BRCA1启动子在部分乳腺癌组织中发生了甲基化，而癌旁正常乳腺组织和乳腺良性病变组织中均未发生甲基化。进一步分析发现，在乳腺癌组织中BRCA1蛋白的表达与其启动子CpG岛甲基化状态呈负相关。发生启动子甲基化的BRCA1蛋白在乳腺癌组织中多为阴性表达，而未发生启动子甲基化的BRCA1蛋白多呈阳性表达。因此，推测在散发性乳腺癌中，BRCA1基因启动子的甲基化是导致其表达显著下调的主要机制。

[1]Zakhartseva LM，Gorovenko NG，Podolskaya SV，et al.Breast cancer immunohistochemical features in young women with BRCA 1/2 mutations[J].Exp Oncol，2009，31(3):174-178.

[2]King MC，Marks JH，Mandell JB，et al.Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2[J].Science，2003，302(5645):643-646.

[3]Chenevix-Trench G，Healey S，Lakhani S，et al.Genetic and histopathologic evaluation of BRCA1 and BRCA2 DNA sequence variant s of an known clinical significance[J].Cancer Res，2006，66(4):2019-2027.

[4]Bonatti F，Pepe C，Tancredi M，et al.RNA-based analysis of BRCA1 and BRCA2 gene alterations[J].Cancer Genet Cytogenet，2006，170(2):93-101.

[5]任婕，魏敏杰，金峰，等.散发性乳腺癌中影响BRCA1蛋白失表达的参数分析[J].中国肿瘤临床，2008，35(2):99-103.

[6]De Siervi A，De Luca P，Byun JS，et al.Transcriptional autoregulation by BRCA1[J].Cancer Res，2010，70(2):532-542.

[7]Morris JR，Boutell C，Keppler M，et al.The SUMO modification pathway is involved in the BRCA1 response to genotoxic stress[J].Nature，2009，462(7275):886-890.

[8]Milne RL，Antoniou AC.Genetic modifiers of cancer risk for BRCA1 and BRCA2 mutation carriers[J].Ann Oncol，2011，22 Suppl 1:i11-7.

[9]Fulan D，Sahnane N，Bernasconi B，et al.APC alterations are frequently involved in the pathogenesis of acinar cell carcinoma of the pancreas，mainly through gene loss and promoter hypermethylation[J].Virchows Arch，2014，464(5):553-564.

[10]Fiolka R，Zubor P，Janusicova V，et al.Promoter hypermethylation of the tumor-suppressor genes RASSF1A，GSTP1 and CDH1 in endometrial cancer[J].Oncol Rep，2013，30(6):2878-2886.

[11]Lee JJ，Ko E，Cho J，et al.Methylation and Immunoexpression of p16(INK4a) Tumor Suppressor Gene in Primary Breast Cancer Tissue and Their Quantitative p16(INK4a) Hypermethylation in Plasma by Real-Time PCR[J].Korean J Pathol，2012，46(6):554-561.

[12]Yu Y，Luo R，Lu Z，et al.Biochemistry and biology of ARHI(DIRAS3)，an imprinted tumor suppressor gene whose expression is lost in ovarian and breast cancers[J].Methods Enzymol，2006，407:455-468.

[13]Kajabova V，Smolkova B，Zmetakova I，et al.RASSF1A Promoter Methylation Levels Positively Correlate with Estrogen Receptor Expression in Breast Cancer Patients[J].Transl Oncol，2013，6(3):297-304.

[14]Rice JC，Ozcelik H，Maxeiner P，et al.Methylation of the BRCA1 promoter is associated with decreased BRCA1 mRNA levels in clinical breast cancer specimens[J].Carcinogenesis，2000，21(9):1761-1767.

Expression and abnormal methylation BRCA1 in sporadic breast cancer*

WeiWei，LiQiuyun，TangWei，JiangYi，JiYinan，YangHuawei，LiuJianlun△

(DepartmentofBreastSurgery，CancerHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China)

Objective To investigate expression and promoter methylation status of BRCA1 in sporadic breast cancer.Methods The expression of BRCA1 mRNA and protein were detected in 60 cases of sporadic breast cancer，the adjacent breast tissues，and 30 cases of breast benign lesion tissue by RT-PCR and and immunohistochemical staining respectively.The methylation status of BRCA1 promoter in those tissues were detected using bisulfite genomic sequencing PCR (BSP) combined with TA clone for sequencing．The relation between BRCA1 expression in sporadic breast cancer and promoter methylation status was analyzed.Results The expression level of BRCA1 mRNA and protein were down-regulated in sporadic breast cancer tissues compared to the corresponding adjacent breast tissues and breast benign lesion tissue(P<0.001).The positive rates of BRCA1 protein was 51.7%(31/60)in sporadic breast tissue，which were significantly lower than those of in the adjacent breast tissues 71.7%(43/60)and breast benign lesion tissue 66.7%(20/30)(P<0.001).The methylation rate of BRCA1 promoter CpG was 31.7%(19/60)in sporadic breast，while it wasn′t found in adjacent breast tissues and breast benign lesion tissue(P=0.000).The statistical analysis showed the expression of BRCA1 had significant negative correlation with promoter methylation(r=-0.345，P=0.007).Conclusion The hypermethylation of BRCA1 promoter could induce BRCA1 down-regulating，which may be involved in the occurrence and development of sporadic breast cancer.

breast neoplasms;BRCA1;gene;methylation

·基础研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.09.007

广西自然科学青年基金资助项目(2011GXNSFB018102)。

韦薇(1978-)，副主任医师，博士，主要从事乳腺癌的基础与临床研究。

△通讯作者，Tel：(0771)5308635；E-mail:gxzlwxwk@126.com。

R730.2

A

1671-8348(2015)09-1174-03

2014-10-08

2014-12-15)