基于显微高光谱成像技术的运动和感觉神经分类研究

房 娟，刘洪英＊，陈增淦，徐沁同

（1．华东师范大学 信息与科学技术学院 上海市多维度信息处理重点实验室，上海200241；2．复旦大学附属中山医院骨科，上海200032）

周围神经主要包含感觉神经以及运动神经。在修复损伤的周围神经时，只有将相匹配的两断端神经纤维进行正确的镜面吻合，才能保证神经修复的效果。因此，寻求一种快速、简便而准确的方法来鉴别神经束的功能成分一直是显微外科医生们面临的重大课题［1］。现有的识别神经束性质的方法包含解剖学方法、电生理法、组织化学法、同位素法等［2］，但都存在自身的缺陷与不足，其中组织化学法是现今周围神经修复手术中识别神经性质最常用的方法。该方法利用了运动神经内核易被胆碱酯酶染色、感觉神经内核不易被胆碱酯酶染色的特性，该特性表明两类神经内核的组成成分上存在差异。但这种差异是否也体现在光谱信息上？王虎等［2］取新西兰白兔的前后根脊神经做冰冻横切片进行喇曼光谱观察发现，同类标本显微激光喇曼光谱重现性好，光谱特征基本相似；但在两种不同类标本中，某些特征喇曼峰的相对强度和峰宽存在明显差异，可借此区分运动神经及感觉神经。岳喜军等［3］利用近红外漫透射方式对Beagle狗的前后根脊神经进行快速采样并以它们的近红外吸收图谱进行聚类分析，发现前后根脊神经具有不同的特征光谱，此方法简便且不添加化学试剂，但在减小误差、计算机分析方法及识别模型等问题上仍需进一步研究。

本文也将基于光谱信息对两类神经的分类问题进行有效地探究。首先寻找能够代表两类神经的纯净像元，再通过定性、定量的分析其特征光谱不同类别之间的差异以找寻合适的分类算法，最终达到不添加化学试剂便能快速、准确分类运动和感觉神经的目的。

1 实验部分

1．1 实验仪器与方法

显微高光谱成像技术融合了遥感中高光谱成像技术和显微镜技术，通过对生物样本进行光谱成像，以获取检测样本的显微图像信息及反映其透射率的光谱信息。采用实验室中显微高光谱神经采集系统对兔子的脊髓前根及脊髓后根的单独未染色切片样本进行采集，获取兔子的运动神经及感觉神经高光谱图像数据。如图1（a）所示，本系统主要由基于AOTF的分光计（包括射频驱动器）、显微镜、面阵CCD相机、图像采集卡及计算机等几部分组成。计算机通过控制射频驱动器达到控制分光计分光的目的，每次设置只允许特定波长的光通过进入面阵CCD相机，CCD采集样本的空间两维图像，而图像采集卡则实现数据的实时采集。一次采集得到一幅特定波段的两维数据，通过控制射频驱动器经多次采集，便可获得不同波段的多幅图像数据。

图1 显微高光谱系统及数据的图谱表示

由于生物组织切片在可见光范围具有吸收光谱特征，在充分考虑AOTF部件特性的情况下，本显微高光谱成像系统从技术可行性上选择光谱范围在可见光及近红外区域［6］。在频率范围为99～178MHz（对应的波长范围为545～894nm）内，以1MHz为间隔控制射频驱动器将其分别作用于80个工作频率，并在每一工作频率下采集1幅高光谱图像，共采集80幅高光谱图像，用波段数（Band Number）作为波长序号表示每一个工作频率具有的对应波长。采集得到的三维图像数据立方体如图1（b）所示，x、y轴表示二维图像的位置坐标，z轴即指示不同工作频率下获取的高光谱图像。对于二维图像中像素点（i，j）处所对应的光谱曲线如图1（c），横轴使用波段数对应不同波长，纵轴即为该像素点在不同波长下对应的亮度值。

由于AOTF分光计的频率与波长呈非线性关系，在不同波长处的光谱分辨率也不尽相同，光谱分辨率在545nm处达2nm，在800nm处为5 nm。系统有效像元设定为1024×1024，系统采集的整个视场大小为63μm×63μm，则其空间分辨率约为0．0615μm。本系统采集的高光谱图像数据存储格式为BSQ（band sequential，按波段顺序储存），它先将图像同一波段的数据逐行存储下来，再以相同的方式存储下一波段的数据。该格式易于获取图像单个波谱波段的空间点（x，y）的信息，提供了最佳的空间处理能力。

1．2 神经高光谱图像数据分析

1．2．1 数据预处理

由于受到系统光源、光路中透镜以及传感器性能的影响，原始的高光谱图像数据不能真实反映生物组织样本的生化特性，因此，首先需要对原始高光谱数据进行预处理，以提高后续数据分析的准确性。使用刘洪英［6］等提出的空间维和光谱维联合辐射校正算法进行数据预处理。该算法的关键是获得基于相同状态下采集的空白样本高光谱数据的光谱维灰度校正系数k1（i，j，λ）和空间维灰度校正系数k2。对于大小为N×M×Dimension的图像，定义如下：

其中B（i，j）表示空白样本在点（i，j）上所有波段的亮度平均值；B（i，j，λ）表示空白样本在点（i，j）上波段为λ的亮度值；则经光谱维校正后的空白样本高光谱图像数据为B′（i，j，λ）＝B（i，j，λ）×k1（i，j，λ），由于计算所得B′（i，j，λ）各像素点在各个波段上的亮度值相同，则B′（i，j）为取其中任意一个波段的数据。

生物样本的原始高光谱数据S（i，j，λ）经过空间维和光谱维联合校正后的高光谱数据S′（i，j，λ）为：

经实验验证，该方法能很好地对原始数据进行去噪和辐射校正。

1．2．2 纯净像元提取

光谱成像仪所获取的生物样本的光谱信息是以像元为单位记录的，不同种类的物质其光谱响应特征不同，由于显微镜分辨率的限制，每个像元所对应的位置可能包含多种种类，而每个像元却仅用一个信号记录这些异质成分，所以需从包含多种光谱特征的“混合像元”集合中提取只包含一种光谱特征的“纯净像元”，通过纯净像元获得的特征光谱便包含这一类光谱的特征信息，这些特征信息对于分析、分类多类别的高光谱图像具有一定的意义。

为获取能够包含各类别数据特征信息的端元波谱，本文采取的纯净像元提取算法流程图如图2所示，首先用最小噪声分离（Minimum Noise Fraction Rotation，MNF）变换方法分离高光谱图像数据中的噪声，确定其内在维数以降低随后计算量；然后将基于MNF变换后的数据用纯净像元指数（Pixel Purity Index，PPI）方法寻找光谱中最纯净的像元；进而用N维可视化分析方法进一步定位、识别、聚集数据集中最纯的像元。

图2 纯净像元提取流程图

（1）最小噪声分离

MNF变换实质上是进行两次主成分变换（Principal Component Analysis，PCA），其主要目的是分离数据中的噪声，判断光谱图像内在的维数，减少后续数据处理中的运算量。第一次变换用于分离和重新调节数据中的噪声，使变换后的噪声数据只有最小的方差而没有波段间的相关。第二次变换是对噪声白化数据进行标准PCA变换。不同于PCA变换后各分量按方差从大到小排列，MNF变换后的特征域中不同波段按照信噪比从大到小排列，克服了噪声对图像质量的影响。特征值较大的波段主要包含数据，特征值接近于1的波段主要包含噪声，通过显示MNF波段特征图像并结合MNF特征值图表可以判定数据的内在维数。

（2）纯净像元指数

PPI将n维散点图迭代映射为一个随机单位向量，通过记录每次映射的极值像元，以及每个像元被标记为极值即处于单位向量末端的像元的总次数，从而生成一幅纯净像元图像。在这幅图像上，每个像元的像素值与像元被标记为极值的次数（即在某些映射下像元被认为是纯净像元的次数）相对应，数值越大说明对应的像元越“纯”。这些次数同时也反映接近每个像元的数据集的局部凸率以及每个像元与数据凸面的接近程度。像元值较高的地方接近n维数据集群凸出的拐角，因而它比像元值较低的像元相对更纯净。通过对像元纯度指数图像设置适当的阈值即可提取相对纯净的像元。在进行PPI计算的过程中，需注意参与运算的波段数、迭代次数和阀值这3个参数的设置问题。

（3）n维可视化分析

将n维可视化工具与MNF和PPI的结果联系起来，利用散点图法可将样本进一步提纯以提高精度。散点图是指将相同位置上的不同光谱值所构成的向量在其空间中的分布，每个n维像元波谱可以认为是n维散点图中的点，n维空间中的点坐标由n个值组成，它们是一个给定像元的每个波段的波谱值，这些点在n维空间中的分布可以用来估计波谱的端元数以及它们的纯波谱信号数。根据凸面几何理论，位于散点图中的犄角像元可以作为端元，即端元信息主要集中在散点图中的几何拐角处。由此，可以根据散点图来进行图像端元的选择，通过散点的运动使不同的样本分离以获取异类样本的波谱终端端元。

1．2．3 分类算法

本 文 选 择 K 近 邻 （K－Nearest Neighbor，KNN）分类算法对运动神经与感觉神经进行实验性分类。由于KNN方法主要靠周围有限的邻近的样本，而不是靠判别类域的方法来确定所属类别的，因此对于类域的交叉或重叠较多的待分样本集来说，KNN方法较其他方法更为适合。该方法的思路是：如果一个样本在特征空间中的k个最相似（即特征空间中最邻近）的样本中的大多数属于某一个类别，则该样本也就属于这个类别，KNN算法中所选择的邻居都是已经正确分类的对象。

对于距离度量方法，本文选择经典的欧氏距离和光谱角距离算法。欧氏距离（Euclidean distance）主要描述了光谱向量的亮度差异，对于高光谱图像的亮度敏感。相较之下，光谱角度匹配（Spectral Angle Match，SAM）作为向量角度差异性测度，所描述的距离测度更注重向量的方向，对于多光谱图像的亮度并不敏感。

2 结果与讨论

运动神经元与感觉神经元的胞体大小不一、形态各异。其结构与一般细胞相似，包含有细胞膜、细胞质和细胞核。在细胞膜上有各种受体和离子通道，二者各由不同的膜蛋白所构成；细胞核多位于神经细胞体中央，大而圆，异染色质少，多位于核膜内侧；细胞质位于核的周围，其中含有发达的高尔基复合体、滑面内质网、丰富的线粒体、尼氏体及神经原纤维，还含有溶酶体、脂褐素等结构。具体运动神经及感觉神经图像如图3右所示，其中灰色表示细胞外的背景区域、白色为细胞质所在区域、黑色为细胞核所在区域。从图像易观察、像元易提取的角度，实验选择细胞质及细胞核作为区分两类神经的特征，由于所含成分的差异，其所对应的光谱信息也应该存在不同。

2．1 运动神经与感觉神经特征光谱

根据纯净像元提取算法，使用ENVI软件在对原始数据进行MNF变换和PPI变换之后，实验分别获取了感觉神经和运动神经的内核及细胞质的纯净像元。根据n维可视化分析中的凸面几何理论，端元信息主要集中在散点图中的几何拐角处，再结合ENVI软件中n维可视化分析工具，将不同拐角处的像元标记为不同颜色，实验中将两个主要拐角标记为红色与绿色，其散点图如图3（a）左及3（b）左所示；散点图经标记后对应到原始图像中其纯净像元位置指示即如图3（a）右及3（b）右所示，正方形框出部分红色像元，圆形框出部分绿色像元。对比原始图像中黑色区域的神经内核及浅色区域的神经细胞质部分发现，该算法提取出的纯净像元的类别能够与数据实际所属类别相对应，说明了该算法的有效性。

图3 神经内核及细胞质纯净像元位置指示

图4 运动神经和感觉神经特征光谱对比

将提取出的运动神经与感觉神经内核及细胞质的纯净像元分别求均值以获得特征光谱，其光谱曲线如图4所示，实线表示神经内核的特征光谱，虚线表示细胞质的特征光谱，经比较发现，两种神经的内核及细胞质的光谱曲线之间存在明显差异，但是运动神经与感觉神经的内核之间、细胞质之间的光谱曲线具有很大的相似性。为进一步比较两种神经的内核及细胞质的光谱曲线，统一坐标系后，运动神经和感觉神经的内核和细胞质特征光谱曲线对比如图5所示，实线代表感觉神经，虚线代表运动神经。由图5（a）可知，两种神经内核的光谱曲线走势相似但感觉神经内核的光谱值要高于运动神经的光谱值；由图5（b）可知，两种神经细胞质的光谱曲线存在比较明显的差异。

图5 神经内核及细胞质特征光谱对比

2．2 分类结果

结合运动神经与感觉神经内核及细胞质特征光谱的差异，基于K近邻分类器，选择欧式距离与波谱角距离算法对运动与感觉神经内核及细胞质的分类作实验性探究，选取一部分运动与感觉神经内核及细胞质纯净像元作为已知类别信息的训练样本，依据这些训练样本的类别信息判断测试样本的类别。训练样本包含像元数为460的运动神经内核样本、像元数为523的运动神经细胞质样本、像元数为540的感觉神经内核样本和像元数为521的感觉神经细胞质样本，测试样本数目及不同K值情况下，测试样本的类别信息判别准确度如表1所示。

根据实验结果对比分析得：

1）欧式距离与波谱角分类算法对于运动和感觉神经具有一定的分类效果，但分类效果并不都非常好。可能原因一是两种神经的内核及细胞质之间的波谱形状及波谱值相似性较大，容易造成判断错误；二是本文使用的纯净像元提取算法所获得纯净像元仍包含一些混合像元；三是分类精度表现与训练样本及测试样本的数量有关。

表1 运动神经和感觉神经分类精度比较The comparison for the accuracy of motor nerve and sensorynerve classification

2）欧氏距离分类精度要高于波谱角分类算法，因为波谱角分类算法关注两光谱曲线的走势，欧氏距离分类算法关注空间中点之间的距离，对比观察图5中各特征光谱对比结果，两神经内核特征光谱的形状几乎一致，但大小存在明显差异，所以针对神经数据分类，SAM的分类效果差于欧氏距离分类。

3）同一测试样本针对不同K值其分类精度不同，取K值较大时，各类别数据的分类精度有所下降，由于各个类别光谱相似性较大，在空间分布中各类别数据点存在交叉，一种类别的数据较易判别为另一种类别。所以对于KNN分类需选择合适的K值。

3 结论

本文应用MNF变换、PPI、n维可视化分析获得兔子运动神经与感觉神经内核及细胞质的纯净像元，通过该纯净像元获取各类别的特征光谱，极大地减少了人工通过图像寻找特征光谱所带来的主观性。特征光谱包含了能够区分这一类光谱数据的特征信息，通过对比特征光谱可以发现各类别间光谱数据的相似性与差异，这为后续找寻合适且更具针对性的分类算法奠定了重要基础。实验表明兔子运动神经与感觉神经内核及细胞质的特征光谱具有很大的相似性，但也存在差异。经结合欧氏距离与光谱角距离两种距离度量算法的K近邻分类器的验证，运动神经与感觉神经高光谱图像数据具有一定的可分性，为进一步提高分类精度，后续实验可以考虑对高光谱数据进行特征空间变换，将神经内核与细胞质的特征进行多特征融合以达到最终分类出两种神经的目的。

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