蒺藜皂苷对局灶性脑缺血大鼠炎症反应和血脑屏障通透性的影响*

翟凤国，周福波，李厚忠，郭素芬，林峰，关利新

(牡丹江医学院药理学教研室，牡丹江 157011)

·药物研究·

蒺藜皂苷对局灶性脑缺血大鼠炎症反应和血脑屏障通透性的影响*

翟凤国，周福波，李厚忠，郭素芬，林峰，关利新

(牡丹江医学院药理学教研室，牡丹江 157011)

目的 探讨蒺藜皂苷对大鼠脑缺血-再灌注损伤炎症反应和血脑屏障通透性的作用及其机制。方法 斯泼累格·多雷(SD)大鼠60只，随机分为假手术组、模型对照组、蒺藜皂苷小剂量组(10 mg·kg-1)、蒺藜皂苷大剂量组(30 mg·kg-1)，每组15只，采用线栓法制备脑缺血-再灌注损伤模型。缺血2 h再灌注24 h后分别检测大鼠神经功能损伤评分、缺血脑组织髓过氧化物酶(MPO)的活性和伊文思蓝(EB)的含量；采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测脑组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量，免疫印记法检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达变化。结果 与模型对照组比较，蒺藜皂苷小、大剂量组大鼠神经功能损伤减轻(P<0.05)，缺血脑组织MPO活性和EB含量均明显降低(P<0.05或P<0.01)，TNF-α含量明显降低[分别为(0.760±0.110)，(0.670±0.073)mg·g-1，模型对照组为(0.920±0.128)mg·g-1，P<0.05或P<0.01)]，MMP-9 的表达水平均明显降低[分别为(1.770±0.181)%，(1.480±0.146)%，模型对照组为(2.200±0.186)%，P<0.01]。结论 蒺藜皂苷对大鼠脑缺血-再灌注损伤的脑组织具有神经保护作用，其机制可能与降低TNF-α含量和下调MMP-9表达，从而降低炎症反应和血脑屏障通透性有关。

蒺藜皂苷；缺血-再灌注，脑；炎症；血脑屏障；基质金属蛋白酶

缺血性脑血管病是危害人类生命和健康的常见病，其所涉及的病理生理机制十分复杂，脑缺血-再灌注是多数缺血性脑血管病的主要病理生理过程。脑缺血-再灌注损伤发生后，血-脑屏障破坏，脑组织水肿，同时炎症细胞也更易于通过破坏的血脑屏障，浸润到脑组织中，加重脑组织损伤[1-2]。蒺藜皂苷是从蒺藜地上全草中提取的有效组分之一，是以甾体皂苷为主的十多种皂苷的混合物，临床主要用于心脑血管疾病的治疗。研究表明，蒺藜皂苷对脑缺血损伤具有脑保护作用[3-4]，但蒺藜皂苷对炎症反应和血脑屏障作用的相关研究较少，笔者进一步探讨蒺藜皂苷在脑缺血-再灌注损伤时脑保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠60只，体质量270～320 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[实验动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001；合格证号：114007-00059799]。所有大鼠常规饲料饲养，自由饮水和摄食，室内安静，每日光照12 h，室温控制在 20～25 ℃，相对湿度(60±40)%。

1.2 药品及试剂 蒺藜皂苷由吉林敖东洮南药业股份有限公司提供，含量>90%。伊文思蓝(Evans blue，EB)染料购于北京鼎国生物技术有限公司(批号：20110616)。髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)检测试剂盒(批号：20110906)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒(批号：20110813)购自南京建成生物技术公司。兔抗大鼠基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.3 动物分组及给药 将大鼠随机分为4组，即假手术组、模型对照组、蒺藜皂苷小剂量(10 mg·kg-1)组和蒺藜皂苷大剂量(30 mg·kg-1)组，每组15只。给药组均于术前灌胃给药7 d，每天灌胃1次。模型对照组和假手术组给予相同体积0.9%氯化钠注射液。

1.4 脑缺血模型的制备 根据LONGA线栓法[5-6]加以改进，10%水合氯醛(300 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，取颈部正中切口，钝性分离左侧颈总和颈内、外动脉，结扎颈外动脉。在颈外动脉近分叉处剪一“V”形切口，插入头端烧圆涂蜡呈钝形的直径为 0.245 mm 的尼龙鱼线，线栓插入深度18～20 mm(距离颈总动脉分叉点)，有轻微阻力时停止，扎紧并固定栓线，缝合皮肤，2 h后抽提栓线至颈总动脉内制备再灌注损伤模型。假手术组只分离血管，不插入尼龙线。

1.5 神经功能损伤评分 参照LONGA等[5]介绍的5分法对脑缺血24 h后 的大鼠进行神经功能评分。0分：无神经功能缺损症状；1分：提尾悬空不能伸展对侧前爪；2分：行走向右侧转圈；3分：行走困难，并向右侧倾倒；4分：不能自发行走，伴意识障碍。神经功能缺损达 1～3 分者纳入实验。

1.6 脑组织EB含量的测定 脑缺血23 h后，经舌下静脉注射2% EB溶液1 mL，大鼠全身迅速变蓝。1 h后，处死大鼠，取出大脑，将缺血侧大脑组织匀浆置于50%三氯醋酸中混匀，放置24 h，测定620 nm处吸光度(A)值。同时测定已知浓度的梯度EB溶液的A值，并绘制标准曲线。根据标准曲线计算出待测样品的EB含量。

1.7 脑组织MPO活性测定 取缺血侧大鼠脑组织，利用试剂盒提供的匀浆介质，将脑组织制成 10%组织匀浆，按MPO试剂盒说明书进行操作。采用考马斯亮蓝法测蛋白质含量。

1.8 脑组织TNF-α的含量测定 取缺血侧大鼠脑组织，匀浆，按ELISA检测试剂盒说明书步骤操作测定脑组织中TNF-α的表达。

1.9 免疫印迹法(Western blot)检测脑组织MMP-9的表达水平 取缺血侧大鼠脑组织100 mg加入到1 mL蛋白裂解液，匀浆，离心提取总蛋白，并测定蛋白浓度。经灌胶、上样、10% 聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭等步骤后，分别加入兔抗大鼠 MMP-9 多克隆抗体(1：500)、鼠抗大鼠β-actin单克隆抗体(1：1 000)，4 ℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的相应二抗(1：2 000)，室温孵育2 h，再经洗膜缓冲液洗膜，超敏电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)试剂盒A液和B液反应，压片、X线胶片曝光显影、图像采集。再用Image Pro-Plug 610图像分析软件测定目的条带的累积A值，以β-actin为内参照，以目的条带的累积A值与β-actin条带的累积A值比值作为目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 蒺藜皂苷对大鼠脑缺血神经功能损伤的影响 假手术组大鼠神经功能无损伤，脑缺血-再灌注24 h 后，模型对照组大鼠神经功能损伤评分与假手术组比较显著增高，蒺藜皂苷能减轻脑缺血-再灌注大鼠的神经功能损伤评分(F=17.14，P<0.05)。结果见表1。

2.2 蒺藜皂苷对大鼠脑组织EB含量的影响 脑缺血-再灌注24 h后，大鼠脑组织EB含量明显增高；与模型对照组比较，蒺藜皂苷小剂量组和大剂量组缺血脑组织EB含量均明显降低(F=21.08，P<0.01)。结果见表1。

表1 4组大鼠神经功能损伤评分和脑组织EB含量比较

与假手术组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.05，*3P<0.01Compared with sham operation group，*1P<0.01; compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

2.3 蒺藜皂苷对大鼠脑组织MPO活性的影响 脑缺血-再灌注24 h后大鼠脑组织MPO活性明显增高；与模型对照组比较，蒺藜皂苷小剂量组和大剂量组缺血脑组织MPO的活性均明显降低(F=52.01，P<0.01)。结果见表2。

2.4 蒺藜皂苷对大鼠脑组织TNF-α含量的影响 脑缺血-再灌注24 h后，大鼠脑组织TNF-α的含量明显增高。与模型对照组比较，蒺藜皂苷小剂量组和大剂量组缺血脑组织TNF-α的含量均明显降低(F=33.40，P<0.01)。结果见表2。

表2 4组大鼠脑组织MPO活性和TNF-α含量比较

与假手术组比较，*1P<0.01；与模型对照组比较，*2P<0.05，*3P<0.01Compared with sham operation group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01

2.5 蒺藜皂苷对大鼠脑组织MMP-9表达水平的影响 脑缺血-再灌注24 h后，大鼠脑组织MMP-9的蛋白表达水平明显增高。与模型对照组比较，蒺藜皂苷小剂量组和大剂量组缺血脑组织MMP-9 蛋白表达水平均明显降低。与假手术组比较，脑缺血再灌注24 h后大鼠脑组织MMP-9的蛋白表达水平明显增高[(1.280±0.143)%，(2.200±0.186)%，P<0.01]。而与模型对照组比较，蒺藜皂苷小剂量组和大剂量组缺血脑组织MMP-9 的蛋白表达水平均明显降低[(1.770±0.181)%，(1.480±0.146)%，F=30.39，P<0.01]。见图1。

图1 4组大鼠脑组织MMP-9的表达

Fig.1 MMP-9 expression in brain in four groups of rats

3 讨论

脑缺血-再灌注后炎症反应和炎症因子的释放可以增加血脑屏障通透性，而血脑屏障通透性的增加一方面加重脑水肿，另一方面有利于炎症因子和炎症细胞通过血脑屏障，促进炎症反应和细胞凋亡[7-8]。因此，抑制炎症、降低血脑屏障通透性从而减轻脑缺血-再灌注损伤是临床治疗目的之一。

本实验通过建立大鼠脑缺血-再灌注模型，证实了蒺藜皂苷具有减轻脑缺血神经功能损伤作用，即蒺藜皂苷对大鼠脑缺血具有神经保护作用，这与以往研究一致[3-4]。同时发现，蒺藜皂苷治疗组缺血脑组织中MPO活性均明显降低。MPO是中性粒细胞的特异性标志物，其活性可反映中性粒细胞的浸润程度及组织炎症反应的程度[9]。提示蒺藜皂苷可显著减轻脑缺血-再灌注损伤诱导的炎症反应。蒺藜皂苷可明显降低脑组织TNF-α的含量。TNF-α是体内最重要的炎症递质之一，研究表明脑缺血早期TNF-α水平增高，且与神经功能缺损程度相关[10]。TNF-α的激活在脑缺血炎症反应中起着核心作用，介导炎症级联反应，诱导巨噬细胞、内皮细胞、胶质细胞及炎症递质等的表达，加重脑损伤，扩大脑梗死体积[11]。蒺藜皂苷可能是通过减少TNF-α的表达来抑制炎症反应，从而减轻脑缺血-再灌注损伤。

EB是小分子指示剂，与血浆蛋白结合后不能通过

血脑屏障，只有当血脑屏障破坏时才进入脑组织，可作为评估血脑屏障损伤的定性指标。本研究结果显示，蒺藜皂苷可明显降低缺血脑组织EB的含量，表明蒺藜皂苷可减轻脑缺血-再灌注损伤所致的血脑屏障破坏。蒺藜皂苷也可明显降低缺血脑组织MMP-9 的蛋白表达水平。MMPs是分解细胞外基质最重要的一类蛋白酶类。研究表明脑缺血后MMPs分解细胞外基质、破坏基底膜并开放血脑屏障是导致脑缺血-再灌注损伤病情加重的重要因素之一[12]。MMP-9是MMPs家族的主要成员，其表达量和活性的增高可促进血脑屏障通透性的增高，促进脑水肿和白细胞浸润，早期选择性抑制MMP-9可显著减轻脑梗死[13]。因此，推测蒺藜皂苷可能是通过降低 MMP-9 的表达改善血脑屏障的完整性，从而减轻缺血性脑损伤。

综上所述，蒺藜皂苷可能通过抑制 TNF-α 的表达、减轻炎症反应，抑制 MMP-9 表达、减轻血脑屏障破坏，进而减轻大鼠脑缺血-再灌注损伤，发挥其对大鼠脑缺血的神经保护作用。

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Effects of Gross Saponins of Tribulus terrestris L. on Inflammatory Reaction and Permeability of Blood-brain Barrier in Rats Following Cerebral Ischemic Injury

ZHAI Fengguo，ZHOU Fubo，LI Houzhong，GUO Sufen，LIN Feng，GUAN Lixin

(DepartmentofPharmacology，MudanjiangMedicalUniversity，Mudanjiang157011，China)

Objective To explore the effects of gross saponins ofTribulusterrestrisL.on inflammatory reaction and permeability of blood-brain barrier in rats following cerebral ischemia-reperfusion injury and their potential mechanisms. Methods Sixty SD rats were divided into sham operation group，model control group，gross saponins ofTribulusterrestrisL.at low-dose (10 mg·kg-1)and high-dose groups(30 mg·kg-1).Cerebral ischemia -reperfusion model was established with suture emboli method in middle cerebral artery of rats.Neural injury scores，the contents of Evans blue (EB) and myeloperoxidase( MPO) activities in rat brain were measured 24 hours after the cerebral reperfusion post 2 h ischemia.Content of tumor necrosis factor-α (TNF-α) in rat brain was detected by ELISA; expression levels of matrix metalloproteinase-9(MMP-9) in rat brain was determined by Western blot. Results Compared to the model control group，the neurological deficit scores were significantly decreased(P<0.05)，MPO activities and EB contents decreased(P<0.05 orP<0.01)in the treatment groups.The expression levels of TNF-α were significantly lower in the treatment groups(0.760±0.110) mg·g-1and (0.670±0.073) mg·g-1compared to (0.920±0.128) mg·g-1in the model control group (P<0.05 orP<0.01).The MMP-9 expression levels were (1.770±0.181)% and(1.480±0.146)%，significantly lower than(2.200±0.186)% in the model control group(P<0.01). Conclusion Gross saponins ofTribulusterrestrisL.exert neuroprotective effects on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats through inhibiting the inflammatory reaction and decreasing the permeability of blood-brain barrier，which may be associated with the decrease of the TNF-α content and downregulation of the MMP-9 expression.

Gross saponins ofTribulusterrestrisL.;Ischemia-reperfusion， cerebral;Inflammation; Blood-brain barrier; Matrix metalloproteinase

2014-04-22

2014-09-23

*黑龙江省教育厅科学技术研究项目(11551527)；黑龙江省卫生厅科研课题(2012-276)；牡丹江医学院科学技术研究项目(2010-02)

翟凤国(1974-)，女，黑龙江鹤岗人，副教授，博士，研究方向：心脑血管病药理。电话：(0)15145331192，E-mail：zhaifengguo1974@163.com。

关利新(1960-)，男，黑龙江牡丹江人，教授，博士生导师，研究方向：心脑血管病药理。电话：0453-6984213，E-mail：guanlixin777@163.com。

R282.71；R285

A

1004-0781(2015)09-1131-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.002