复方鹿角霜片的质量控制*

张雨薇，王燕燕，王亚芬，张凯林

(1.三峡大学第一临床医学院、宜昌市中心人民医院，宜昌 443003；2.湖北华龙生物制药有限公司，孝感 430028)

复方鹿角霜片的质量控制*

张雨薇1，王燕燕1，王亚芬2，张凯林2

(1.三峡大学第一临床医学院、宜昌市中心人民医院，宜昌 443003；2.湖北华龙生物制药有限公司，孝感 430028)

目的建立复方鹿角霜片的质量控制方法。方法采用薄层色谱法对制剂中鹿衔草、忍冬藤进行定性鉴别，采用高效液相色谱法测定忍冬藤中的马钱苷、当药苷，鹿衔草中的水晶兰苷的含量。结果定性鉴别薄层色谱斑点清晰，特征明显，专属性强；高效液相色谱法测定含量，专属性强，在范围内水晶兰苷、马钱苷、当药苷进样浓度与色谱峰面积均呈良好的线性关系(r>0.999)，平均回收率分别为97.2%，98.4%，96.0%，RSD分别为1.4%，0.8%，0.8%。结论利用薄层色谱法定性、高效液相色谱法定量，方法简便准确，重复性好，可有效控制复方鹿角霜片的质量。

鹿角霜片，复方；水晶兰苷；马钱苷；当药苷；色谱法，高效液相；质量控制

复方鹿角霜处方来源于宜昌名老中医孙庭富祖传一百余年的经验方，具有强筋健骨、祛风、除湿，疏利关节，抗炎消肿的功效，被宜昌市中心人民医院引用于治疗类风湿关节炎[1]。该处方由鹿角霜、鹿衔草、忍冬藤、蜂房、桂枝和桑枝6味药材组成。有报道称鹿角霜具有抗炎、调节免疫作用[2-3]，鹿衔草提取物能够抑制一氧化氮的产生进而发挥抗炎作用[4]，忍冬藤水煎液对小鼠卡拉胶性足跖肿胀炎症模型和二甲苯性耳廓肿胀炎症模型均具有较好的抗炎作用[5]，蜂房水提液也具有显著的抗炎镇痛作用[6-7]。本品用于治疗多种类型的类风湿性关节炎疗效确切，安全可靠，不良反应少，并且能在一定程度上减少糖皮质激素用量，从而降低用药毒副反应，减轻患者经济负担，提高患者生活质量，用药前景良好。为有效控制产品质量，笔者在本实验中对其进行了质量控制研究。

1 仪器与试药

1.1 仪器 戴安Ultimate 3000型高效液相色谱仪(色谱工作站：Chromeleon，进样器：U3000型自动进样器；检测器：DAD 3000型)；BT-25S型电子分析天平(Satorius，感量：0.01 mg)；KH3200E型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司)；

1.2 试药 水晶兰苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111870-201302)；马钱苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111640-201005)；当药苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111742-200501)；复方鹿角霜片(武汉健民药业集团股份有限公司，批号：20130601，20130602，20130603，每片0.45 g)；乙腈为色谱纯；水为双蒸水；其他试剂皆为分析纯。

2 方法与结果

2.1 定性鉴别

2.1.1 忍冬藤的薄层层析鉴别 取本品5片，除去包衣，研细，加乙醇20 mL，加热回流30 min，滤过，滤液浓缩至约3 mL，置已处理好的活性炭-氧化铝柱上[依次加入活性炭0.5 g及中性氧化铝2 g，内径10～20 mm]，用乙醇30 mL洗脱，收集洗脱液，置水浴上蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。取马钱苷对照品，加乙醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。另取忍冬藤对照药材2 g，加乙醇30 mL，加热回流30 min，滤过，滤液浓缩至约1 mL，作为对照药材溶液。再按处方比例称取除忍冬藤外的其余5味药材，同法制得阴性样品溶液，按供试品溶液的制备进行提取，即得[8]。照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验，吸取对照品溶液及对照药材溶液各5 μL、供试品溶液及阴性样品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-冰醋酸-水(12：3：5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，置105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰。见图1。

1.马钱苷；2.忍冬藤对照药材；3.复方鹿角霜片；4.阴性对照

图1 忍冬藤的薄层色谱鉴别[温度：(15±2) ℃；相对湿度：(70±5)%]

1.loganin；2.reference of lonicerae japonicae caulis；3.compound cornu cervi degelatinatum tablets；4.negative control

Fig.1 Qualitative identification of lonicerae japonicae caulis by TLC[temperature：(15±2) ℃；relative humidity：(70±5)%]

2.1.2 鹿衔草的薄层层析鉴别 取本品5片，除去包衣，研细，加乙醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，取上清液作为供试品溶液。取鹿衔草对照药材1 g，加乙醇20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，取上清液作为对照药材溶液。另按处方比例称取除鹿衔草外的其余五味药材，同法制得阴性样品溶液[9]。照薄层色谱法(《中华人民共和国药典》2010年版一部附录ⅥB)实验，吸取对照药材溶液5 μL、3批供试品溶液(批号：20130601，20130602，20130603)及阴性样品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(5：4：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相同位置上，显相同颜色的主斑点，阴性对照无干扰，见图2。

1.鹿衔草对照药材；2～4.3批复方鹿角霜片；5.阴性对照

图2 鹿衔草的薄层色谱鉴别[温度：(15±2) ℃；相对湿度：(70±5)%]

1.reference of pyrola herba；2-4.three batches of compound cornu cervi degelatinatum tablets；5.negative control

Fig.2 Qualitative identification of pyrola herba by TLC [temperature：(15±2) ℃；relative humidity：(70±5)%]

2.1.3 忍冬藤和鹿衔草的高效液相色谱法鉴别 在”2.2.5”项下含量测定专属性实验项下的供试品液相色谱图中，供试品应显示与水晶兰苷、马钱苷和当药苷对照品保留时间一致的色谱峰，见图3。

2.2 复方鹿角霜片含量测定

2.2.1 色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent Zorbax SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；以0.4%磷酸溶液-乙腈为流动相，按表1进行线性梯度洗脱。柱温27 ℃，检测波长236 nm，流速1.0 mL·min-1[10]。

2.2.2 对照品溶液的制备 分别取水晶兰苷、马钱苷、当药苷对照品各10 mg，精密加水定容至50 mL至溶解，制成每毫升中含水晶兰苷、马钱苷、当药苷各200 μg的溶液，作为对照品储备液。分别精密量取储备液适量，加水定量稀释成每毫升含水晶兰苷40 μg、

A.缺忍冬藤阴性样品溶液；B.缺鹿衔草阴性样品溶液；C.混合对照品溶液；D.供试品溶液；1.水晶兰苷；2.马钱苷；3.当药苷

图3 复方鹿角霜片专属性实验色谱图

A.negative control without lack of lonicerae japonicae caulis；B.negative control without pyrolae herba；C.mixed control solution；D.samples；1.monotropein；2.loganin；3.chiratin

Fig.3 Chromatograms of specificity test on compoundcornucervidegelatinatumtablets

马钱苷40 μg及当药苷40 μg的溶液，作为混合对照品溶液。

表1 含量测定流动相条件

Tab.1 Mobile phase of content determination %

时间/min0．4%磷酸溶液乙腈0982～11982～1298→862→14～408614～5086→9814→2

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品10片，除去包衣，研细，取约1.0 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入水50 mL，超声处理30 min，放冷，滤过，续滤液作为供试品溶液[11-12]。

2.2.4 阴性样品溶液的制备 按处方比例分别制备不含忍冬藤和鹿衔草的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法同法制备忍冬藤阴性样品溶液以及鹿衔草阴性样品溶液。

2.2.5 专属性实验 分别取混合对照品溶液、供试品溶液以及阴性样品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。结果显示阴性样品溶液色谱图中在与混合对照品溶液色谱峰相应的位置上无色谱峰出现，阴性无干扰，见图3。

2.2.6 线性关系考察 取“2.2.2”项下的水晶兰苷、马钱苷、当药苷对照品储备液，分别精密量取对照品贮备液0.5，1.0，2.0，3.0，5.0，8.0，10.0 mL置1～7号10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；分别精密量取10 μL依次注入液相色谱仪，记录色谱峰面积。由溶液浓度(X)对色谱峰面积(Y)进行线性回归，结果见表2。

表2 3种成分的回归方程 Tab.2 Regression equation of three constituents

2.2.7 精密度实验 精密称取供试品溶液(复方鹿角霜片，批号：20130601)，重复进样6次，水晶兰苷、马钱苷、当药苷色谱峰面积的RSD%分别为0.6%，0.6%，0.7%，表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性实验 精密称取供试品溶液(复方鹿角霜片，批号：20130601)，室温放置，分别于0，1，2，4，8，12，16，24 h时，精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，计算RSD。水晶兰苷、马钱苷、当药苷峰面积的RSD分别为0.8%，0.7%，0.9%，说明待测液在24 h内稳定。

2.2.9 加样回收率实验 取已知含量的供试品(批号：20130601，水晶兰苷含量：1.213 mg·g-1，马钱苷含量3.087 mg·g-1，当药苷含量1.547 mg·g-1) 6份，每份约1.0g，精密称定，置100 mL量瓶中，分别精密加入水晶兰苷0.373 6 mg·mL-1、马钱苷0.425 2 mg·mL-1及当药苷0.401 2 mg·mL-1的对照品溶液各5 mL，照供试品溶液的制备方法制备6份供试品溶液，精密吸取供试品溶液20 μL，注入液相色谱仪，测定，结果见表3。

2.2.10 重复性实验 取同一批样品(批号：20130601)6份，照“2.2.3”项下供试品溶液的制备方法进行配制，进行液相分析，计算得水晶兰苷、马钱苷、当药苷含量的RSD分别为1.3%，1.2%，1.1%。结果表明重复性良好。

2.2.11 供试品含量测定 分别称取3个不同批次的复方鹿角霜片样品各1.0 g，依法制成供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定供试品溶液中水晶兰苷、马钱苷、当药苷含量，结果见表4。

3 讨论

鹿角霜《中华人民共和国药典》2010年版收载中仅用外观性状来进行鉴别，无特异性方法。鉴于鹿角霜与鹿茸等鹿制品均含多种氨基酸，参照《中华人民共和国药典》2010年版一部鹿茸项下的鉴别方法对鹿角霜进行了理化及薄层色谱鉴别方法预试，结果表明供试液中蜂房提取物对测定有干扰，不适用于本品中鹿角霜的鉴别，但将理化鉴别、薄层鉴别订入鹿角霜药材质量标准，以达到控制成品的质量。经查阅文献，桂枝的鉴别方法大多采用桂皮醛等挥发油，但由于本品采用水提醇沉工艺，桂皮醛等成份的提取率较低，不适用于本品中桂枝的鉴别，故未采用。桑枝《中华人民共和国药典》收载中仅采用显微方法进行鉴别。由于本处方中桑枝非原药材粉入药，是采用水煮醇沉工艺制得，故显微鉴别方法不可行。参照《中华人民共和国药典》2010年版一部桑白皮项下薄层鉴别方法，对本品中桑枝鉴别进行了方法学研究，结果显示阴性对照有干扰，不适合本品中桑枝的鉴别。

经方法学研究表明：鹿衔草及忍冬藤薄层鉴别方法展开效果良好，专属性强，最终将鹿衔草、忍冬藤鉴别订入了质量标准中。

由于中药处方的成分复杂且含量微小，一般的方法难以对复杂的中药处方进行分离和检测[13]。笔者在本实验中选用高效液相色谱-二极管阵列检测器法同时测定复方鹿角霜片中水晶兰苷、马钱苷以及当药苷3种有效成分，方法灵敏，简便，可操作性强。建立方法的同时进一步对流速、柱温、流动相比例、测定波长等因素进行了筛选。根据二极管阵列检测器采集得到的在190～400 nm波长范围内结果，最终选择236 nm作为检测波长，与《中华人民共和国药典》2010年版一部鹿衔草中水晶兰苷，忍冬藤中马钱苷含量测定检测波长基本一致。

通过本研究建立的复方鹿角霜片薄层色谱定性鉴别，以及高效液相色谱定量测定的方法，简便、准确，重复性好，可有效控制产品质量。

表3 3种成分加样回收率实验结果 Tab.3 Results of recovery tests on three constituents

表4 3批复方鹿角霜片每片含量测定结果

Tab.4 Results of content determination on each tablets of three batches of compoundcornucervidegelatinatumtablets

mg

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《医药导报》编辑部

Quality Control of Compound Cornu Cervi Degelatinatum Tablets

ZHANG Yuwei1, WANG Yanyan1, WANG Yafen2, ZHANG Kailin2

(1.TheFirstCollegeofClinicalMedicalScience,ChinaThreeGorgesUniversity&YichangCentralPeople`sHospital,Yichang443003,China； 2.HubeiHualongBiopharmaceuticalLimitedCompany,Xiaogan430028,China)

Objective To establish a method of quality control for compoundCornucervidegelatinatumtablets. Methods Thin layer chromatography (TLC) was used for qualitative identification ofLoniceraeJaponicaeCaulisandPyrolaHerbain the preparations.High performance liquid chromatography was used to determine the content of loganin and chiratin inLoniceraeJaponicaeCaulisand monotropein inPyrolaHerba. Results The TLC spots were clear and specific in the qualitative identification.HPLC determined the content.In the concentration range, monotropein, loganin and chiratin had a good linear relationship with peak area (r>0.999).The mean recovery was 97.2%, 98.4% and 96.0%； RSD was 1.4%, 0.8% and 0.8%. Conclusion The present study employs TLC for quality control and HPLC for quantity control.The methods are simple and accurate, have good reproducibility, and can effectively control the quality of compoundCornucervidegelatinatumtablets.

Cornucervidegelatinatumtablets, compound； Monotropein； Loganin； Chiratin； Chromatography, high performance liquid； Quality control

2015-01-08

2015-03-12

*国家”重大新药创制”科技重大专项项目(2011ZX09102-006-05)

张雨薇(1990-)，女，黑龙江鸡西人，在读硕士，研究方向：天然药物化学。电话：(0)13035132949，E-mail：m13035132949@163.com。

王燕燕(1964-)，女，湖北宜昌人，教授，博士研究生，主任药师，硕士生导师，研究方向：医院药学。电话：0717-6487741，E-mail：wangyy1001@163.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)12-1644-05

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.024

导报》论文

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