金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶检测方法的应用比较

刘敬王斌沈继录00中科院合肥物质研究院肿瘤医院检验科0000中国科技集团公司第8研究所卫生院0000安徽医科大学

金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶检测方法的应用比较

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230031中科院合肥物质研究院肿瘤医院检验科1
230000中国科技集团公司第38研究所卫生院2
230000安徽医科大学3

目的：比较头孢硝噻吩液体（Cefinase）、头孢硝噻吩纸片（Dryslide）、三叶草实验（Cloverleaf）、青霉素边缘实验（Penicillin disk zone edge）检测金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶的敏感性和特异性。方法：分别用Cefinase，Dryslide，Cloverleaf，Penicillin disk zone edge检测金黄色葡萄球菌β-内酰胺酶。结果：4种方法敏感度分别为83％、66％、91％、91％。特异度分别为100％、97％、100％、100％。结论：4种方法在检测应用上都能为临床提供可靠的结果，但Cloverleaf和Penicillin disk zone edge检测β-内酰胺酶的试验较敏感，在操作上用头孢硝噻吩纸片法更能被实验室所接受。关键词 β-内酰胺酶；金黄色葡萄球菌；头孢硝噻吩液体；青霉素纸片

β-内酰胺酶类抗生素因其抗菌活性高、毒性低的优点属现今临床各种感染最常用的药物[1]。随着β-内酰胺类抗生素的广泛应用甚至滥用以及致病菌的变迁，使得产生β-内酰胺酶的病原菌越来越多，是目前造成细菌高度耐药的重要原因之一[2]。现对本院2013年1-12月临床分离的12株对青霉素敏感的金黄色葡萄球菌和30株对青霉素耐药的金黄色葡萄球菌用Cefinase液体法（A）、Dryslide干粉法（B）、Cloverleaf法（C）和Penicillin disk zone edge（D）同时进行β-内酰胺酶检测，比较4种方法检测结果的敏感性和特异性。

资料与方法

材料：①菌株来源：临床分离的对青霉素敏感的金黄色葡萄球菌12株和临床分离的对青霉素耐药的金黄色葡萄球菌30株，均来自本院2013年1-12月住院及门诊患者送检的标本。质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC 29213为产酶阳性对照菌，金黄色葡萄球菌ATCC 25923为产酶阴性对照菌。②仪器：使用德国西门子细菌分析仪做细菌鉴定和药敏实验，青霉素纸片（10U）、试剂购自英国OXOID公司，头孢硝噻吩纸片购自梅里埃诊断产品（上海）有限公司，头孢硝噻吩液体购自美国BD公司。

方法：①Cefinase液体法：Cefinase用梅里埃诊断产品，让试剂放置于室温条件中，用无菌去矿物水浸湿纸片，沾取少量待测菌菌落到纸片表面，出现红色为阳性，1 h后无颜色改变为阴性。②Dryslide干粉法：Dryslide法用美国BD公司的头孢硝噻吩干粉，以Nitrocefin Rehydration 2mL稀释液将Nitrocefin 1mg稀释，将头孢硝噻吩液体滴在待测菌上，颜色由黄色变为红色为阳性，不变色为阴性。③Cloverleaf法：Cloverleaf用金葡菌标准菌株涂布，待测菌划线，十字交界处帖青霉素纸片，培养24 h观察结果。④Penicillin disk zone edge：青霉素边缘试验用待测菌配成0.5浊度涂布，然后做青霉素纸片药敏试验，培养24 h观察结果，抑菌圈＞19mm为阳性。

统计学方法：采用χ2检验分别做4种方法检出结果的差异检验和关联性检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

结果

对青霉素敏感的金葡菌12株，对青霉素耐药的金葡菌30株。结果见表1、表2。

讨论

本文通过用4种方法同时对青霉素敏感的金黄色葡萄球菌12株和临床分离的青霉素耐药的金黄色葡萄球菌30株进行检测，其检测结果差异无统计学意义（χ2=0.50，P＞0.05），充分说明四种方法就本实验室的β-内酰胺酶检测应用中的可行价值。

2013CLSI以前曾经推荐：假如青霉素的抑菌圈≥29mm或最小抑菌浓度≤0.12μg/mL时，在报告“S”时应采用头孢硝噻吩测定β-内酰胺酶。继续划线分离后续菌株，可以考虑采用PCR测定BlaZ基因[3]。

当有β-内酰胺酶存在时，头孢硝噻吩的β-内酰胺环能被β-内酰胺酶破坏，使其颜色由黄色变为红色，在操作方法上，头孢硝噻吩纸片法是目前单底物中最敏感的，且广谱，简便易行，特异性高达100％，但其在某些条件下仍出现假阳性、假阴性，敏感性较低。头孢硝噻吩液体法虽然较头孢硝噻吩纸片法敏感度有所提高，但较纸片法操作复杂，在临床不建议使用，适合科研，易保存[4]。Cloverleaf法敏感度91％，特异度100％，Cloverleaf法最大的优势在于将ATCC25923（β-内酰胺酶诱导阴性的指示菌）质控和待测菌同时涂抹于5％羊血平板上，待测菌划线，贴10 U青霉素纸片，培养24 h，观察结果。结果较明显。

寻求一种特异度好、敏感度高的检测方法，正是检验工作者的共同目标，因为只有保证质量，才能为临床提供有价值的报告，也才能更好地为患者服务。常用的β-内酰胺酶检测方法除以上4种外，还有微生物活性消失法、酸测量法、碘量法等[5]，但目前最常用的方法还是青霉素边缘实验法，因其操作简便，如无法开展淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、莫拉菌等药敏试验的实验室，用此法替代就能给临床诊治带来方便。因此，在对β-内酰胺酶检测方法的选择上，青霉素边缘实验法更能被广大实验室所接受，而做好β-内酰胺酶检测工作更显得极为重要。葡萄球菌的多重耐药性除与产生β-内酰胺酶有关外，与抗生素的不合理使用也密切相关。因此，选择一种特异度好、敏感度高的细菌鉴定药敏方法，作为临床医生合理选药的参考指标，为临床合理使用抗生素提供了有力的保障。

表1 4种方法检测β-内酰胺酶结果

表2 4种方法检测β-内酰胺酶敏感度和特异度（％）

[1] 陈艳清,贾建.头孢硝噻吩纸片法检测P-内酰胺酶的评价[J].中华医院感染学杂志, 2004,14（2）：25-27.

[2] 唐群力.两种β-内酰胺酶检测方法的应用比较[J].检验医学与临床,2008,5（7）：427-428.

[3] 熊自忠.β-内酰胺酶的研究新近展[J],中国抗感染化疗杂志,2001,1（1）：61-62.

[4] 马文杰,吴镝,刘芳,等.医院感染产β-内酰胺酶金黄色葡萄球菌耐药性研究分析[J].中华医院感染学杂志,2014,（20）：4958-4960.

[5] 袁红萍,周文俊,朱奋勇,等.临床常见病原菌的分布及耐药性分析[J].中华医院感染学杂志,2014,（8）：1854-1856.

Com parison of the app lication o f detection m ethods on Staphylococcus aureusβ-lactam ase

Liu Jing1,Wang Bin2,Shen Jilu3
DepartmentofLaboratory,CancerHospitalofHefei Institute ofMaterial,Chinese Academy ofSciences2300311
The No.38Research Institute ofHealth,China Technology Group Corporation 2300002
AnhuiMedicalUniversity2300003

Objective：To compare the sensitivity and specificity of nitrocefin liquid（Cefinase）,nitrocefin paper（Dryslide）,clover experiment（Cloverleaf）,penicillin edge experiments（Penicillin disk zone edge）in the detection of Staphylococcus aureus β-lactamase.Methods：We detected Staphylococcus aureusβ-lactamase by Cefinase,Dryslide,Cloverleaf,Penicillin disk zone edge respectively.Results：The sensitivity of the 4methodswas 83％,66％,91％,91％.The specificitywas 100％,97％,100％,100％.Conclusion：The 4methods can provide reliable results for the clinicalapplication,but the Cloverleafand disk zoneedge Penicillin testing are sensitive to the test of theβ-lactamase.Themethod of the Nitrocefin paper can bemore accepted by the laboratory from the operation.

β-lactamase；Staphylococcusaureus；Nitrocefin liquid；Penicillin paper

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.27.76