不同免疫抑制状态小鼠鲍曼不动杆菌的致病性差异研究

赵 旭， 肖舒心， 郭蓓宁

·论著·

不同免疫抑制状态小鼠鲍曼不动杆菌的致病性差异研究

赵 旭， 肖舒心， 郭蓓宁

目的构建正常小鼠、轻度和重度免疫抑制小鼠鲍曼不动杆菌肺炎模型，研究不同免疫状态下鲍曼不动杆菌的致病性。方法①分别构建正常小鼠、轻度和重度免疫抑制小鼠鲍曼不动杆菌肺炎模型；②144只ICR雌性小鼠随机分为6组，分别为正常对照组（组1）、轻度免疫抑制组（组2）、重度免疫抑制组（组3）、感染组（组4）、轻度免疫抑制感染组（组5）及重度免疫抑制感染组（组6），每组24只小鼠。气管插管后组1、组2、组3经气管插管注射生理盐水10μL，组4、组5、组6注射鲍曼不动杆菌菌液（3.8×108CFU/mL）10μL；③分别于0、24、48、72、120和168 h 6个时间点每组随机选取4只小鼠，进行血白细胞和中性粒细胞计数、小鼠肺组织细菌计数，以及肺组织病理检查。结果组6有5只小鼠死亡，病死率达到20.8%，余组无死亡。组4为免疫功能正常小鼠，感染鲍曼不动杆菌后2 d肺内细菌全部被清除，白细胞及中性粒细胞计数在感染后1～3 d明显上升，5～7 d后基本恢复正常水平，病理示一过性肺组织损伤包括局部肉芽肿形成及肺间质损伤；组6为重度免疫缺陷小鼠，在感染后肺组织中的细菌量持续增长，第3天上升至感染初期的145倍，之后菌量减少。感染2 d内白细胞及中性粒细胞始终处于极低水平，3 d后逐渐恢复至正常水平，至第7天明显升高至正常水平的2倍以上，组织病理示感染7 d后整叶肺呈实变、坏死，肺泡、支气管及血管结构均被破坏；组5与正常小鼠感染过程类似，细菌在第3天被完全清除。结论正常小鼠感染鲍曼不动杆菌后，肺内细菌可以完全清除，但仍有一过性肺组织病理损伤；重度免疫抑制小鼠感染后细菌会在肺内增殖，肺组织病理损伤随时间延长明显加重；机体不同免疫状态可影响鲍曼不动杆菌感染的发展和转归。

鲍曼不动杆菌； 小鼠肺炎模型； 免疫抑制； 致病性

鲍曼不动杆菌属不发酵糖革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界、医院及人体皮肤，主要引起医院获得性肺炎，尤其是呼吸机相关性肺炎，亦可引起血流感染、脑膜炎、腹膜炎、伤口感染等多种感染［1］。该菌是医院感染最常见细菌之一，尤其是多重耐药鲍曼不动杆菌（multidrug-resistantAcinetobacter baumanii），即同时对3种以上不同类型的抗菌药物耐药的鲍曼不动杆菌，甚至泛耐药菌株（pan-drugresistantAcinetobacterbaumanii）不断增多，常在重症监护病房、血液科病房等引起流行，导致治疗困难，病死率高，临床迫切需要新的有效治疗方法［2］。鲍曼不动杆菌作为条件致病菌，致病力较弱。文献报道免疫功能正常小鼠采用超声雾化吸入法或微量气管直接注射等方法肺部接种细菌，72 h后细菌均可被清除，无法形成肺部感染，只有采用大剂量免疫抑制剂或激素等破坏小鼠免疫系统才能形成肺炎［3-4］，提示机体免疫系统尤其是天然免疫在抵抗鲍曼不动杆菌感染中可能起重要作用［5］。为对鲍曼不动杆菌的致病性和免疫状态进行深入研究，课题组前期采用耳窥镜直视下气管插管法成功构建了小鼠鲍曼不动杆菌肺炎模型［6］。本研究采用此模型研究在正常、轻度免疫抑制、重度免疫抑制等不同免疫状态下鲍曼不动杆菌的致病性，以初步反映鲍曼不动杆菌的毒力，其感染机体后宿主的免疫反应以及细菌引起肺部感染的病理过程，从而为进一步研究鲍曼不动杆菌致病机制和与宿主免疫系统相互作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 鲍曼不动杆菌HS-1511为临床分离菌株，2011年分离自上海华山医院住院患者脑脊液标本。微量稀释法药敏结果显示该菌对临床常用抗革兰阴性杆菌药物亚胺培南、头孢哌酮-舒巴坦等均耐药，仅对替加环素及多黏菌素敏感。

1.1.2 试剂 环磷酰胺，批号SLBC0666V，麻醉剂2，2，2-三溴乙醇，批号STBC1157V，均购自Sigma公司；LB Broth培养基，批号14012937G，LB Agar培养基，批号14012950G，均购自上海生工公司；生理盐水，批号WFI21110，旭东海普制药公司生产；甲醛组织固定剂，批号20131022，中山市康乃欣生物医疗科技有限公司生产；苏木精-伊红染色剂，批号120812，上海化学试剂公司生产。白细胞稀释液，批号20110507，南京建成生物工程研究所生产。

1.1.3 实验动物 ICR清洁级小鼠，鼠龄6周左右，体重20～25 g，雌性，合格证号；SCXK（沪）；2012-0002，购自上海斯莱克实验动物有限公司。小鼠饲养温度18～25℃，相对湿度50%～70%，本实验使用小鼠144只。

1.1.4 实验器材和仪器 小鼠气管插管工具盒，美国Braintree公司产品，型号为RW-A3747，包括电池手柄、耳镜头、3.5 mm耳窥镜、门齿环、小鼠气管内导管、喉镜；一次性气管插管（采用BD公司1.1 mm×30 mm一次性使用静脉留置针）；啮齿动物工作台，美国Braintree公司产品，型号RWA3467；摇床，美国New Brunswick科技公司生产，型号innova 4200；分析天平，瑞士METTLER TOLEDO公司生产，型号XS205；紫外可见光分光光度计，美国UNIC公司产品，型号UV-2102C型；组织匀浆机，法国Bertin公司precellys 24多功能生物样品均质器；电子显微镜，日本Nikon公司E2000电子显微镜。

1.2 方法

1.2.1 小鼠鲍曼不动杆菌肺炎模型的建立 采用耳窥镜直视下气管插管法构建小鼠鲍曼不动杆菌肺炎模型［6］。具体方法简要描述如下。

1.2.1.1 诱导小鼠免疫抑制 在实验前4 d和前1 d分别采用腹腔注射50 mg/kg和50 mg/kg、200 mg/kg和150 mg/kg环磷酰胺分别诱导小鼠轻度或重度免疫抑制。

1.2.1.2 菌液制备 挑取LB平皿上生长的单个鲍曼不动杆菌菌落，置10 mL LB液体培养基中于摇床中37℃、150 r/min振荡培养2 h至A值0.1左右（600 nm），取5 mL细菌悬液4℃、4 000 r/min离心10 min，弃上清液后采用1 mL生理盐水悬浮制备菌液，取100μL菌液经系列稀释后接种于LB培养基培养16 h后行菌落计数，菌液浓度约为2.0 ×108～5.0×108CFU/mL。

1.2.1.3 小鼠气管插管及菌液注射 1.25%2，2，2-三溴乙醇（25 mg/kg）腹腔注射，待小鼠麻醉后仰卧位固定小鼠于啮齿动物工作台上，采用美国Braintree公司气管插管工具盒行耳窥镜直视下行小鼠气管插管。气管插管成功后，沿气管插管注射10μL鲍曼不动杆菌菌液，吹打3次，确保菌液全部进入小鼠肺部。

1.2.1.4 肺组织细菌定量 待麻醉小鼠全部苏醒，颈椎脱臼法处死小鼠，无菌操作取出小鼠两侧肺，称重后每0.1 g肺加入0.9 mL生理盐水，组织匀浆机研磨，取混悬液100μL经系列稀释后接种于LB培养基培养16 h后行菌落计数，继而计算出每克肺组织的细菌含量。

1.2.2 不同免疫抑制状态小鼠鲍曼不动杆菌的致病性差异

1.2.2.1 实验分组及设计 根据本课题组既往的研究结果，在实验前4 d和前1 d分别腹腔注射环磷酰胺200 mg/kg和150 mg/kg后，第0天小鼠血液中性粒细胞计数下降约90%，为重度免疫抑制；注射50 mg/kg、50 mg/kg后，中性粒细胞计数下降约20%，为轻度免疫抑制［7］。依据上述研究结果，将144只小鼠随机分为6组，分别为正常对照组（组1）、轻度免疫抑制组（组2）、重度免疫抑制组（组3）、感染组（组4）、轻度免疫抑制感染组（组5）和重度免疫抑制感染组（组6），每组均为24只小鼠。其中组2和组5在实验前4 d和前1 d分别采用环磷酰胺50 mg/kg和50 mg/kg腹腔注射后诱导轻度免疫缺陷；组3和组6在实验前4 d和前1 d分别采用环磷酰胺20 mg/kg和150 mg/kg腹腔注射后诱导重度免疫缺陷；组1和组4小鼠均不给予环磷酰胺，为免疫功能正常的小鼠。在实验当日（day 0）6组小鼠均按上述方法行气管插管后，组1、组2、组3沿气管插管注射10μL生理盐水，组4、组5、组6沿插管注射10μL鲍曼不动杆菌菌液（3.8×108CFU/mL），以实验当日最后一只小鼠苏醒的时间记为0 h。

1.2.2.2 观察指标 ①小鼠行为学观察，观察小鼠体型、进食、活动、体毛、呼吸等变化情况；②血常规变化，分别于0、24、48、72、120和168 h 6个时间点从各组小鼠中随机选取4只，从眼眶后静脉丛取血，作血涂片并吸取20μL置于380μL白细胞稀释液中行血常规分析，观察白细胞、中性粒细胞等计数；③肺组织细菌计数和病理检查；每组小鼠分别在上述取血同时间采用颈椎脱臼法处死4只，其中3只采用无菌操作取出小鼠两肺称重后作组织匀浆并行细菌计数，计算每克肺组织中的细菌含量。余1只处死后取出肺组织采用4%甲醛液固定，石蜡包埋、病理切片、苏木精-伊红（HE）染色，用显微镜观察肺组织的炎性反应和病理改变。若出现自然死亡即刻解剖取出肺组织固定后进行病理切片检查。

2 结果

2.1 小鼠行为学观察及死亡率

6 组小鼠均观察至7 d，其中组1进食、活动无明显异常。组2和组3小鼠在0～72 h内饮食及活动减少、体重增加缓慢，但在120 h和168 h一般情况较前好转，组2和组3小鼠无死亡。组4、组5、组6均为鲍曼不动杆菌感染小鼠，感染后出现不同程度呼吸急促、毛发竖立、饮食及活动减少、反应迟钝等表现，以组6症状最为严重，出现了蜷缩、颤抖及体重明显减轻等表现，在48 h有2只死亡，72 h有3只死亡，死亡率达到20.8%。组4和组5症状较组6为轻，主要表现为小鼠嗜睡及毛发竖立，均无小鼠死亡。组4、组5、组6小鼠均以48～72 h症状最为严重，在120 h和168 h情况有所好转，表现为运动较前增多，体重有所增加。

2.2 小鼠外周血中白细胞及中性粒细胞计数

6 组小鼠外周血中白细胞及中性粒细胞平均计数见表1，平均计数随时间变化的趋势见图1、2。其中组1作为组4的对照组，组2作为组5的对照组，组3作为组6的对照组。与组1比较，组4小鼠24 ～72 h白细胞及中性粒细胞计数明显升高，均上升1.7倍左右（P＜0.01），但在120 h和168 h，组1和组4两组白细胞及中性粒细胞计数相似，两组差异无统计学意义（P＞0.05）。显示免疫功能正常小鼠肺部感染鲍曼不动杆菌后血液中白细胞及中性粒细胞计数在感染后24～72 h会明显上升，但在感染后120～168 h基本恢复正常水平；图1、2也显示组4小鼠白细胞和中性粒细胞计数先升后回落至基线水平的变化趋势。组3和组6比较，从0至48 h，两组小鼠白细胞计数始终处于＜1.0×109/L、中性粒细胞计数始终处于＜0.1×109/L这一极低水平（中性粒细胞减少达97%以上），72 h后两组小鼠白细胞及中性粒细胞计数逐渐上升，组3小鼠于感染后168 h恢复正常水平，组6小鼠在感染后168 h白细胞（13.8×109/L）及中性粒细胞计数（8.99×109/L）较组3及其他组小鼠明显升高，达2倍以上，两组差异有统计学意义（P＜0.01）。图1、2显示组3小鼠在接受大剂量免疫抑制剂后白细胞及中性粒细胞计数在0～48 h处于极低水平，自72 h开始上升，至168 h时基本恢复正常值；组6小鼠白细胞及中性粒细胞计数在0～72 h处于极低水平，在120和168 h明显上升，至168 h时白细胞及中性粒细胞计数骤然上升达到正常小鼠2倍以上，甚至超过感染组小鼠。提示这两组小鼠白细胞及中性粒细胞水平受免疫抑制剂环磷酰胺影响较大，但在72 h后环磷酰胺对小鼠血液系统免疫抑制作用减弱，故组3小鼠白细胞及中性粒细胞计数上升至正常，组6小鼠因肺部感染鲍曼不动杆菌故在感染120～168 h后白细胞及中性粒细胞计数水平均较正常小鼠明显上升，提示小鼠肺部感染仍持续存在且较严重。组2和组5两组小鼠白细胞及中性粒细胞水平介于正常小鼠和重度免疫抑制小鼠之间，在0～48 h小鼠白细胞计数较正常小鼠降低50%以上，中性粒细胞计数较正常小鼠降低80%以上，72 h后小鼠白细胞和中性粒细胞基本恢复正常水平，考虑也与72 h后环磷酰胺对小鼠血液系统免疫抑制作用减弱有关，两组小鼠各时间点白细胞及中性粒细胞计数相似。图1、2也显示组2和组5两组小鼠白细胞及中性粒细胞计数在0～72 h处于较低水平，自120 h开始上升，168 h基本恢复正常水平。

表1 不同免疫状态小鼠感染鲍曼不动杆菌后外周血白细胞、中性粒细胞计数Table1 The peripheral white blood cell（WBC）and neutrophils count in mice under different immune conditions after challenge with A.baumannii inoculation

图1 不同免疫状态小鼠感染鲍曼不动杆菌后外周血白细胞计数的变化曲线Figure 1 The curves of peripheral white blood cell count over time in mice under different immune conditions after inoculation of A.baumanniisuspension

图2 不同免疫状态小鼠感染鲍曼不动杆菌后外周血中性粒细胞计数的变化曲线Figure 2 The curves of peripheral neutrophils count over time in mice under different immune conditions after inoculation of A.baumanniisuspension

2.3 小鼠肺组织细菌定量

组1、组2和组3小鼠肺内注射的为生理盐水，故各时间点肺组织细菌量均为0。组4、组5及组6小鼠感染鲍曼不动杆菌后168 h内不同观察点肺组织平均细菌量见表2。可见组4正常小鼠感染鲍曼不动杆菌后24 h肺内细菌量减少为原来1/1 000，至48 h后3只小鼠肺内细菌全部被清除，细菌计数为0，之后72 h直到感染后168 h小鼠肺内无细菌再生长。而组6为重度免疫缺陷小鼠，在感染后24 h肺内菌落计数就上升至感染初期的22倍，此后肺组织中的细菌量持续增长，至72 h上升至感染初期的145倍，达到最高值（7.69×109CFU/g肺组织）；但感染120 h后，随着环磷酰胺对血液系统骨髓抑制作用的减弱，小鼠中性粒细胞水平上升，细菌被部分清除，表现为肺内细菌量有所减少，至感染后168 h小鼠肺内细菌量最少，降至最高峰的1/200，接近0 h水平。组5为轻度免疫缺陷小鼠，与正常小鼠感染鲍曼不动杆菌过程类似，24 h肺内细菌量减少为原来的1/1 000，至48 h发现3只小鼠中仅有1只小鼠肺内存在细菌，其细菌计数为1.40×103CFU/g肺组织，减少为最初接种细菌量的1/104，至72 h细菌全部被清除，之后直到感染后168 h小鼠肺内再无细菌生长，另2只小鼠肺组织未发现细菌生长。

2.4 小鼠感染后肺病理结果

正常小鼠感染后24～48 h肺组织表现为肺间质充血、水肿，肺泡间隔和部分肺泡腔内见大量单核和淋巴细胞及散在中性粒细胞浸润，在肺组织内有肉芽肿结构形成，同时合并有肺组织和肺间质炎性反应表现；72 h后随着肺内细菌的清除，肺组织病理表现为肺间质炎性反应减轻，感染后168 h肺组织病理表现基本恢复正常，但肺间质炎症仍持续存在，典型病理见图3A～3C。

表2 不同免疫状态小鼠感染鲍曼不动杆菌后肺组织菌落计数变化Table2 Pulmonary colony-forming unit（CFU）of bacteria in mice under different immune conditions after inoculation of A.baumannii suspension （mean±SD）

重度免疫抑制小鼠感染即刻（0 h），肺组织基本正常，肺泡腔开放，肺泡壁无增厚，壁内未见炎性细胞等浸润，有小灶性出血；24～48 h肺泡壁毛细血管充血明显，片状的肺泡腔内可见蓝紫色颗粒状的渗出物，但炎性细胞浸润不明显；72 h肺泡壁毛细血管充血、出血明显，大片状的肺泡腔内可见蓝紫色颗粒状的渗出物及渗出的水肿液，少量炎性细胞浸润，以单核巨噬细胞为主，并伴少量中性粒细胞浸润；168 h整叶肺呈实变、坏死，肺泡、支气管及血管结构均被破坏，局部肺组织可见明显出血，高倍镜下见坏死区域内大量中性粒细胞和脓细胞浸润，典型病理见图3D～3F。

轻度免疫抑制小鼠感染后48 h病理示大片肺泡间隔和部分肺泡腔内见大量单核和淋巴细胞及散在中性粒细胞浸润，肺间质充血；72 h肺间质充血减轻，但仍可见大片肺泡间隔内有多量炎性细胞浸润；168 h围绕支气管壁的肺组织内可见局灶性肉芽肿，中央可见多核巨细胞，并伴有单核巨噬细胞浸润、增生，部分支气管结构破坏，部分支气管壁显著增厚，周围肺组织肺泡壁增厚，可见单核巨噬细胞浸润，典型病理见图3G～3I。

图3 不同免疫状态小鼠感染鲍曼不动杆菌后肺组织病理表现Figure 3 The pathologic findings in three groups of mice with different immune conditions after inoculation of A.baumanniisuspension

3 讨论

鲍曼不动杆菌目前已经成为医院感染重要的致病菌。根据2012年中国CHINET细菌耐药性监测显示，不动杆菌属（其中89.6%为鲍曼不动杆菌）检出率在革兰阴性杆菌中位居第3，仅次于大肠埃希菌和克雷伯菌属［8］。随着广谱抗菌药物，特别是碳青霉烯类在临床上的广泛应用，鲍曼不动杆菌耐药性不断增强，多重耐药和泛耐药鲍曼不动杆菌不断增多，给临床治疗带来极大的困难。泛耐药鲍曼不动杆菌引起的呼吸机相关性肺炎由于缺乏有效药物治疗，且感染此菌的患者绝大部分为终末期患者，免疫力低下，病死率更高，可达40%～70%［9］，故目前对鲍曼不动杆菌致病性及耐药性研究已经成为全球抗感染领域的关注焦点。

既往许多研究报道鲍曼不动杆菌系条件致病菌，在小鼠免疫力正常情况下可不致病，构建小鼠鲍曼不动杆菌感染模型常需要采用免疫抑制剂或激素造成免疫抑制状态才能使小鼠感染。本研究通过不同剂量的免疫抑制剂诱导小鼠不同程度的免疫抑制，以此来研究免疫机制在鲍曼不动杆菌所致肺炎中的作用。

本研究结果与既往研究（仅观察至24 h）结果相似［7］，显示正常小鼠鲍曼不动杆菌肺部感染程度较轻，24 h肺内细菌量减少了近3个Log值，48 h后所有小鼠肺内细菌全部被清除，之后直到感染后168 h小鼠肺内再无细菌生长。虽然鲍曼不动杆菌在正常小鼠肺组织中经48 h即被全部清除，但机体的免疫反应仍对肺组织产生一定损伤；正常小鼠感染后24～48 h肺组织表现为肺间质充血水肿，肺泡间隔和部分肺泡腔内见大量单核细胞和淋巴细胞以及散在中性粒细胞浸润，在肺组织内有肉芽肿结构形成，同时合并有肺组织和肺间质炎性表现，72 h后随着肺内细菌的清除，肺组织病理表现为肺间质炎性反应减轻，感染后168 h肺组织病理表现基本恢复正常，但值得注意的是肺间质炎性反应仍持续存在。正常小鼠外周血白细胞及中性粒细胞计数也有相似表现，感染后24～72 h小鼠白细胞及中性粒细胞计数明显上升，但在感染后120～168 h白细胞及中性粒细胞计数水平基本恢复正常。据文献报道目前考虑在鲍曼不动杆菌引起的感染中，天然免疫特别是中性粒细胞起重要作用［10］。鲍曼不动杆菌侵入机体后，血液中的中性粒细胞和单核-巨噬细胞系统立即识别病原菌，并启动Toll样受体等信号转导通路，引起局部感染部位中性粒细胞和单核-巨噬细胞聚集，并释放细胞因子及趋化因子，吞噬并杀灭细菌［11］。本次动物实验结果验证了这一假设；正常免疫功能小鼠感染鲍曼不动杆菌后，天然免疫立即启动，在48 h内就完全清除了细菌，但局部的免疫炎性反应也造成了肺组织一定的损伤，病理表现为小鼠肺组织内肉芽肿形成及肺间质炎性反应，这可能也与免疫反应过度表达有关。此实验结果提示正常人肺部感染鲍曼不动杆菌后，可能也会发生一过性白细胞及中性粒细胞升高，在组织水平产生肺组织一过性损伤，包括局部肉芽肿形成和肺间质损伤，而此肺间质损伤持续时间至少1周左右，即鲍曼不动杆菌感染后人体可能无临床相关症状、体征，但在组织病理水平可能仍对机体造成一过性伤害。

重度免疫缺陷小鼠，由于大剂量环磷酰胺骨髓抑制作用，白细胞尤其是中性粒细胞水平严重降低（降低97%），机体无法在感染后有效抑制肺内细菌生长，导致细菌持续生长，72 h肺内细菌计数上升至145倍，达到最高值，但到感染120 h后，随着环磷酰胺对血液系统骨髓抑制作用的减弱，小鼠血液中性粒细胞水平上升，细菌被部分清除，表现为肺内细菌量有所减少，至感染后168 h小鼠肺内细菌量降低至最高峰的1/200，为感染初期的水平。肺组织病理表现为48～72 h肺泡壁毛细血管充血明显，片状的肺泡腔内可见蓝紫色颗粒状的渗出物，少量炎性细胞浸润，以单核巨噬细胞为主，并伴少量中性粒细胞浸润，此时小鼠临床表现最重，部分小鼠死亡。病理表现可能由于细菌感染直接造成肺泡毛细血管破裂，但由于小鼠重度免疫抑制状态，中性粒细胞极度缺乏，故感染部位无法形成炎性细胞浸润，无法吞噬感染的细菌，导致炎性反应持续扩散加重，未死亡小鼠肺组织炎性反应进一步发展，至感染后168 h达到最严重状态，肺泡内有大量中性粒细胞浸润、增生，肺泡结构消失，肺组织实变。提示在环磷酰胺骨髓抑制作用消失后，一方面细菌的侵袭作用和毒素对肺组织结构进一步破坏，造成肺组织实变，另一方面中性粒细胞大量增加，局部吞噬细菌作用明显增强，可能在杀灭细菌的同时免疫反应过度表达，进一步造成肺组织的病理损害。重度免疫缺陷组小鼠感染鲍曼不动杆菌后白细胞和中性粒细胞变化也较大；小鼠白细胞及中性粒细胞计数在0～72 h处于极低水平，随后逐渐升高，到168 h白细胞及中性粒细胞计数骤然上升达到正常值2倍以上，超过感染组及其他组小鼠，提示在72 h后免疫抑制剂环磷酰胺作用消失［12］，其对骨髓的抑制作用缓解，由于肺部细菌感染持续存在，促使单核巨噬细胞系统产生粒细胞集落刺激因子等刺激骨髓粒细胞增生，释放加快，使感染后168 h小鼠血中白细胞及中性粒细胞数量大量增加。但本实验仅观察到感染后168 h，重度免疫抑制小鼠肺部细菌和炎性反应持续存在，随后小鼠肺部感染是否痊愈还有待今后实验进一步证实。

轻度免疫缺陷小鼠，虽然感染初期其中性粒细胞水平较正常小鼠降低85%左右（0.2×109/L），但其感染过程却与正常小鼠类似，在感染后72 h肺内细菌已全部清除，且白细胞和中性粒细胞计数在120 h即恢复到正常水平，提示小鼠即使仅有15%的中性粒细胞，仍可保持强大吞噬功能清除造成机体感染的鲍曼不动杆菌，但直至感染后168 h肺组织局部仍有局灶性肉芽肿形成，表现为中央可见多核巨细胞，并伴有单核巨噬细胞浸润、增生，另外局部支气管结构破坏，部分支气管壁显著增厚，周围肺组织肺泡壁增厚，提示轻度免疫抑制小鼠肺内感染鲍曼不动杆菌后，虽然72 h内就完全清除了细菌，但局部的免疫炎性反应造成了肺组织一定的病理损伤，其严重程度较正常小鼠为重，有支气管及肺泡结构破坏，局灶性肉芽肿表现更为严重且持续时间也明显延长，病理损伤持续至感染后168 h。

通过正常小鼠、轻度和重度免疫抑制小鼠感染鲍曼不动杆菌的肺部炎性反应和病理结果比较，可得出以下结论；机体不同免疫状态可影响鲍曼不动杆菌感染的发展和转归，机体在正常免疫情况下感染鲍曼不动杆菌可不致病，提示机体免疫机制对细菌有强大清除力、对轻度感染造成的组织损伤具有一定的修复作用，故提高机体免疫功能可能是治疗鲍曼不动杆菌感染的新方法。

［1］ McConnell MJ，Actis L，Pachon J.Acinetobacterbaumannii；human infections，factors contributing to pathogenesis and animal models［J］.FEMS Microbiol Rev，2013，37（2）；130-155.

［2］ Garnacho-Montero J，Amaya-Villar R.MultiresistantAcinetobacterbaumanniiinfections；epidemiology and management［J］.Curr Opin Infect Dis，2010，23（4）；332-339.

［3］ Joly-Guillou ML，WoLff M，Poeidalo JJ，et al.Use of a new mouse model ofAcinetobacter baumanniipneumonia to evaluate the postantibiotic effect of imipenem［J］.Antimicrob Agents Chemother，1997，41（2）；345-351.

［4］ 余道军，俞云松，方翔，等.亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌小鼠肺部感染模型建立［J］.中华检验医学杂志，2010，33（8）；771-775.

［5］ Mortensen BL，Skaar EP.Host-microbe interactions that shape the pathogenesis ofAcinetobacter baumanniiinfection［J］.Cell Microbiol，2012，14（9）；1336-1344.

［6］ 肖舒心，赵旭，郭蓓宁.采用耳窥镜直视下气管插管法构建小鼠鲍曼不动杆菌肺炎模型［J］.中国感染与化疗杂志，2015，15 （1）；51-56.

［7］ Guo B，Abdelraouf K，Ledesma KR，et al.Quantitative impact of neutrophils on bacterial clearance in a murine pneumonia model［J］.Antimicrob Agents Chemother，2011，55（10）；4601-4605.

［8］ 汪复，朱德妹，胡付品，等.2012年中国CHINET细菌耐药性监测［J］.中国感染与化疗杂志，2013，13（5）；321-330.

［9］ Garnacho J，Sole-Violan J，Sa-Borges M，et al.Clinical impact of pneumonia caused byAcinetobacter baumanniiin intubated patients；a matched cohort study［J］.Crit Care Med，2003，31（10）；2478-2482.

［10］ van Faassen H，KuoLee R，Harris G，et al.Neutrophils play an important role in host resistance to respiratory infection withAcinetobacter baumanniiin mice［J］.Infect Immun，2007，75（12）；5597-5608.

［11］ Knapp S，Wieland CW，Florquin S，et al.Differential roles of CD14 and toll-like receptors 4 and 2 in murineAcinetobacter pneumonia［J］.Am J Respir Crit Care Med，2006，173（1）；122-129.

［12］ 赵弋清，罗霞，陈东辉，等.不同剂量环磷酰胺诱导正常小鼠免疫抑制的对比研究［J］.免疫学杂志，2005，21（3）；s122-s124.

The pathogenesis of Acinetobacter baumannii in mice under different immune conditions

ZHAO Xu，XIAO Shuxin，GUO Beining.（Institute of Antibiotics，Huashan Hospital，Fudan University，Key Laboratory of Clinical Pharmacology of Antibiotics，Ministry of Health，Shanghai 200040，China）

；ObjectiveTo establishAcinetobacter baumanniipneumonia models in normal，mild immunodeficient and serious immunodeficient mice，and to examine the pathogenesis ofA.baumanniiunder different immune conditions.MethodsA.baumanniipneumonia models were established in normal，mild immunodeficient and serious immunodeficient mice，respectively.One hundred and forty-four mice were randomized into 6 groups including control（group 1），mild immunosuppression（group 2），serious immunosuppression（group 3），infection（group 4），infected after mild immunosuppression（group 5）and，infected after serious immunosuppression（group 6），24 mice in each group.After intubation，the mice in group 1，2 and 3 were given sterile saline，while those in groups 4，5，6 were inoculated with 10μL of freshA.baumanniisuspension（3.8×108CFU/mL）.Four mice were sacrificed at 0 h，24 h，48 h，72 h，120 h and 168 h，respectively in each group.Then blood sample and lung tissue were taken from each mouse aseptically for testing white blood cell（WBC）and neutrophils count，quantitative culture and histopathological analysis.ResultsFive（20.8%）mice were dead in group 6，while no mouse was dead in other 5 groups.After inoculation ofA.baumanniisuspension in group 4（normal）mice，pulmonary bacterial burden was eliminated over two days.The WBC and neutrophils count were obviously elevated over 1-3 daysafter infection，and returned to normal over 5-7 days.The histopathologic examination showed transient local granulomas and pulmonary interstitial injury.In group 6，the bacteria multiplied continuously in lungs of serious immunosuppressive mice，increased 145 times over 3 days and then decreased.The total WBC and neutrophils count were extremely low within first 2 days，increased since day 3，and continuously increased up to 2 times of the normal level on day 7.The histopathologic changes showed lung consolidation，necrosis and destruction of alveolus，bronchus and blood vessels.The infection process of mild immunosuppression mice（group 5）was similar to the normal mice（group 4）.The bacteria were eliminated from lungs on day 3.ConclusionsPulmonary bacteria could be eliminated completely in the mice with normal immunity.The pathologic changes showed transient lung injury.The pulmonary bacterial burden multiplied in serious immunosuppression mice accompanied by aggravation of pathologic lung injury.The status of immunity has impact on the development and outcome ofA.baumannii infection.

；Acinetobacter baumannii； pneumonia； animal model； immunodeficiency

R378.996

A

1009-7708（2015）02-0155-08

2014-07-15

2014-08-08

上海市科委实验动物研究专项基金（12140903203）。

复旦大学附属华山医院抗生素研究所，卫生部抗生素临床药理重点实验室，上海 200040。

赵旭（1976—），男，主治医师，主要从事细菌致病性和耐药性研究。

郭蓓宁，E-mail；guobeining®aliyun.com。