二苯并吖庚因注射液对大鼠肺动脉高压的影响

肖清萍，刘建文，张闽红，李富欢，郭东

(江西省吉安市中心人民医院呼吸内科，吉安 343000)

二苯并吖庚因注射液对大鼠肺动脉高压的影响

肖清萍，刘建文，张闽红，李富欢，郭东

(江西省吉安市中心人民医院呼吸内科，吉安 343000)

目的探讨二苯并吖庚因(DBZ)对大鼠肺动脉高压的影响。方法将30只大鼠随机分为正常对照组、模型对照组和DBZ组，每组10只。正常对照组：腹腔注射0.9%氯化钠溶液；模型对照组：建立大鼠肺动脉高压模型，腹腔注射0.9%氯化钠溶液5 mg·kg-1；DBZ组：建立大鼠肺动脉高压模型，静脉注射DBZ 1 mg·mL-1·d-1。超声心动图检测右心室压力，利用苏木精-伊红染色观察肺动脉的重塑，并利用Western Blot法检测肺组织增殖细胞核抗原的表达，CCK-8法检测肺动脉平滑肌细胞的增殖。结果与正常对照组比较，模型对照组大鼠右心室压力增高[(4.60±0.16) kPa比(3.37±0.18) kPa]，差异有统计学意义(P<0.01)，而且肺动脉重塑及肺动脉平滑肌增殖均明显增加。与模型对照组比较，DBZ组大鼠肺组织中右心室压力降低，肺动脉重塑以及肺动脉平滑肌增殖均显著降低。体外实验结果表明，与模型对照组平滑肌细胞比较，低氧诱导后DBZ处理组平滑肌细胞的增殖显著降低[(2.073±0.064)比(4.392±0.013)]，差异有统计学意义(P<0.05)。结论Notch信号通路参与肺动脉高压病理过程，DBZ通过抑制Notch信号通路减少平滑肌细胞增殖，对肺动脉高压大鼠有保护作用。

二苯并吖庚因；Notch信号通路；平滑肌细胞，肺动脉；增殖，细胞；肺动脉高压

肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一种以肺血管阻力持续升高为特征的高致死率临床综合征[1]。目前研究提示肺动脉中层平滑肌细胞增生在肺动脉高压发病机制中起着重要作用[2]。研究证实，肺动脉高压时，参与肺血管重塑的内皮细胞、平滑肌细胞等存在不同程度的Notch家族基因表达上调[3]。研究表明Notch信号转导通路在肺血管形成，血管平滑肌细胞及内皮细胞等增殖、分化、凋亡方面起重要调控作用，参与PAH的发生和发展[4]。二苯并吖庚因(dibenzazepines，DBZ)为抑制Notch信号通路的常用药物。本研究采用大鼠低氧诱导肺动脉高压模型，并利用DBZ干预治疗，观察探讨DBZ对低氧所致大鼠肺动脉高压的影响及机制，为临床治疗肺动脉高压奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SPF级SD大鼠30只，体质量200～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001，实验动物使用许可证号 ：SYXK(京)2012-0024。普通饲养饲料，自由饮水。

1.2 试剂与仪器 DBZ(美国Sigma公司，批号：SML0649)；蛋白提取试剂盒(美国Thermo公司，批号：78503)；增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗体(美国Santa Cruz公司，批号：SC-25280)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydro-genase,GAPDH)抗体(美国Santa Cruz抗体，批号：SC-365062)；细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8)(日本同仁化学公司，批号：CK04)；达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbacco's modified Eagle's medium，DMEM，美国Hyclone公司，批号：SH30022.01B)；胎牛血清(美国Hyclone公司，批号：SH30396.03)；小动物超声仪(Vevo770 ultrasound system，加拿大Visual Sonics公司)。

1.3 动物分组与模型制备 按照随机数字表法分为3组，每组10只：正常对照组(腹腔注射0.9%氯化钠溶液)、模型对照组(低氧处理及腹腔注射0.9%氯化钠溶液)、DBZ组(低氧处理及静脉注射DBZ)。模型对照组及DBZ组SD大鼠置于常压低氧舱，低氧舱充入氮气使氧浓度为(10.0±0.5)%，每天8 h，每周6 d，共4周；正常对照组及模型对照组腹腔注射0.9%氯化钠溶液5 mg·kg-1，DBZ组腹腔注射 DBZ(1 mg·mL-1·d-1)。

1.4 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色观察肺动脉形态 10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主动脉放血处死。分离取出肺，放入0.9%氯化钠溶液漂洗去除血污；用10%甲醛固定组织，脱水，石蜡包埋，切成厚4 μm切片，进行HE染色，观察肺动脉血管壁的形态。

1.5 Western blot检测肺组织PCNA表达 提取大鼠肺组织总蛋白，并测定蛋白浓度。取蛋白80 μg，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gel electrophoresis,SDS-PAGE)后，用半干转电转移法转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h后，分别加入一抗，4 ℃过夜，洗膜后，分别加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠和抗兔IgG(1：1 000稀释)，37 ℃孵育1 h；洗膜后，利用增强化学发光法(enhanced chemiluminescence，ECL)自显影，以GAPDH的表达作为上样参照，目的条带的灰度值与内参条带的灰度值相比较。

1.6 肺动脉平滑肌细胞提取 10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主动脉放血处死。分离取出肺组织，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)溶液漂洗3次，用眼科镊去除肺组织，分离出肺动脉，去除纤维外膜，用眼科剪剖开动脉，将组织剪成组织块1 mm×1 mm，放于15 cm×15 cm培养皿底部，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液2 mL，使培养液掠过组织块，翻转静置37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱中3 h，再次翻转培养皿使组织块浸于培养液中，静置培养。

1.7 CCK-8检测平滑肌细胞的增殖 将平滑肌细胞以5×104个·mL-1接种于96孔培养板中，将细胞分为正常对照组、模型对照组和低氧诱导后加入DBZ处理组(DBZ组)，每组设复孔3个，每孔100 μL培养体系。正常对照组在37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h；模型对照组和DBZ组利用混合气(N294%、CO25%、O21%)置换法低氧分别处理24 h；然后每孔分别加入10 μL的CCK-8试剂，培养箱中孵育3 h，酶标仪检测细胞的A450值。

2 结果

2.1 超声心动图测右心室压力 低氧饲养大鼠4周后，模型对照组及DBZ组右室压力较正常对照组明显增加，表明造模成功(P<0.01)；DBZ组右室压力较模型对照组显著下降，表明抑制DBZ可以改善低氧诱导的肺动脉高压(P<0.01)。见表1。

表1 3组大鼠右心室压力检测结果的比较

Tab.1 Comparison of right ventricular pressure among three groups of rats

组别右心室压力/kPa正常对照组3．37±0．18模型对照组4．60±0．16∗1DBZ组3．75±0．14∗2

与正常对照组比较，t=2.781，*1P<0.01； 与模型对照组比较，t=7.235，*2P<0.01

Compared with normal control group，t=2.781，*1P<0.01；compared with model control group，t=7.235，*2P<0.01

2.2 HE染色结果 常规显微镜显示模型对照组肺动脉血管壁较正常对照组明显增厚，提示造模成功；DBZ组肺动脉血管壁厚度较模型对照组明显减轻，表明DBZ可显著改善低氧诱导的肺动脉高压。见图1。

2.3 PCNA蛋白表达 模型对照组肺组织PCNA蛋白表达量较正常对照组明显增加，提示肺动脉高压中平滑肌细胞增殖增加；DBZ组肺组织PCNA表达量较模型对照组显著降低，表明DBZ可改善肺动脉高压平滑肌细胞的增殖。见图2。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.DBZ组

A.正常对照组；B.模型对照组；C.DBZ组

图2 3组大鼠肺动脉平滑肌细胞PCNA蛋白的表达情况

A.normal control group；B.model control group；C.DBZ group

Fig.2 Expression of PCNA protein in smooth muscle cells of pulmonary artery in three groups of rats

2.4 3组平滑肌细胞增殖情况比较 实验结果显示DBZ组平滑肌细胞在450 nm处的A值较正常对照组明显下降，提示DBZ组平滑肌细胞的增殖较正常对照组显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖率比较

Tab.2 Comparison of proliferation rate of smooth muscles cells in pulmonary artery among three groups of rats

组别A450正常对照组1．240±0．055模型对照组4．392±0．013∗1DBZ组2．073±0．064∗2

与正常对照组比较，t=9.643，*1P<0.01； 与模型对照组比较，t=8.150，*2P<0.01

Compared with normal control group，t=9.643，*1P<0.01；compared with model control group，t=8.150，*2P<0.05

3 讨论

PAH的产生是由不同病因和发病机制引起肺血管阻力持续性增加。持续升高的肺血管阻力可引起右心室压力负荷增加，最终导致右心功能障碍[5]。PAH特征性的病理改变为肺动脉中膜平滑肌细胞增殖导致小动脉管壁增厚和细动脉肌化[6]。研究证实，右心室压力的增高间接反映肺动脉高压的严重程度。本实验结果显示大鼠进行缺氧处理4周后，模型对照组大鼠右心室压力较正常对照组显著增高，表明缺氧处理使大鼠肺动脉压力增高。用DBZ腹腔注射后右心室压力降低，肺动脉血管重塑改善，提示DBZ对缺氧诱导的PAH大鼠有一定保护作用。其作用机制为通过抑制Notch信号通路进而抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖。

本实验显示大鼠缺氧后右心室压力增高，肺动脉血管重塑增加。缺氧处理肺动脉平滑肌细胞后，平滑肌细胞增殖增加。已发现Notch信号通路在PAH中激活，表明了Notch信号通路参与了PAH损伤机制[7]。经DBZ腹腔注射后，肺组织中Notch信号通路受抑制，缺氧后右心室压力降低，肺动脉血管重塑减少。DBZ体外处理缺氧的肺动脉平滑肌细胞，平滑肌细胞增殖显著降低，提示DBZ可能通过抑制平滑肌细胞增殖减轻肺动脉重塑，缓解肺动脉及右心室压力的增高。综上所述，在缺氧诱导大鼠PAH模型中，DBZ通过抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖进而抑制PAH血管重塑过程，研究结果为有效预防肺动脉高压提供了有力的基础。

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Effect of Dibenzazepines Injection on Pulmonary Hypertension in Rats

XIAO Qingping, LIU Jianwen, ZHANG Minhong, LI Fuhuan, GUO Dong

(DepartmentofRespiratoryMedicine，Ji'anCentralPeople'sHospitalofJiangxiProvince,Ji'an343000,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of dibenzazepines (DBZ) injection on pulmonary hypertension in rat. Methods Rat models of pulmonary hypertension were established, and 30 male rats were randomly divided into 3 groups： normal control group with saline injection, pulmonary hypertension model control group with hypoxia treatment and saline injection, DBZ group with hypoxia treatment and DBZ injection.The right ventricular pressure was determined by ultrasound cardiogram.Pulmonary arterial remodeling was detected by HE staining.Proliferation cell nuclear antigen and CCK-8 in pulmonary arterial smooth muscle cells were detected by Western blotting. Results The right ventricular pressure of pulmonary hypertension group was significantly increased compared with normal control group [(4.60±0.16) kPavs.(3.37±0.18) kPa(P<0.01)].After hypoxia treatment, pulmonary arterial remodeling and proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells of the rats of pulmonary hypertension group were augmented remarkably.Rats from DBZ group showed reductions in right ventricular pressure, amelioration in pulmonary arterial remodeling and suppression in proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells.The proliferation of rat pulmonary artery smooth muscle cells decreased significantly in DBZ treated group [(2.073±0.064)vs.(4.392±0.013)] compared with model control group (P<0.05). Conclusion Notch pathway takes part in the process of pulmonary hypertension, and DBZ injection can significantly suppress the proliferation of pulmonary artery smooth muscle cells with a protective effect on pulmonary hypertension.

Dibenzazepines；Notch pathway；Smooth muscle cells,pulmonary arterial； Proliferation, cell；Pulmonary arterial hypertension

2014-03-03

2014-05-31

肖清萍(1981-)，女，江西新干人，主治医师，硕士，从事呼吸内科临床工作。电话：(0)15811549627，E-mail：xiaoqingping12356@126.com。

郭东(1968-)，男，江西吉安人，主任医师，学士，研究方向：内科学。电话：(0)15811549431，E-mail：tgzy820505@163.com。

R972.4； R543.2

A

1004-0781(2015)12-1576-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.12.007