不同产地及不同药用部位马蓝中靛蓝和靛玉红的含量测定

程佩佩，夏叶，方玉，答国政，黄静，张秀桥

(湖北中医药大学药学院，武汉 430065)

不同产地及不同药用部位马蓝中靛蓝和靛玉红的含量测定

程佩佩，夏叶，方玉，答国政，黄静，张秀桥

(湖北中医药大学药学院，武汉 430065)

目的 建立反相高效液相色谱(RP-HPLC)法同时测定不同产地、不同药用部位马蓝中靛蓝、靛玉红的含量。方法 选用Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(75：25)，柱温25 ℃，流速1.0 mL·min-1，检测波长290 nm。结果 靛蓝在0.051 3～0.820 8 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 3)，平均回收率为99.00%，RSD为1.30%(n=6)。靛玉红在0.049 5～0.792 0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 9)，平均回收率为98.88%，RSD为1.51%(n=6)。结论 马蓝中靛蓝、靛玉红因产地和药用部位的不同，含量差异较大。该方法操作简便、快速、可靠，可为马蓝药材的质量控制提供实验依据。

马蓝；靛蓝；靛玉红；含量测定；色谱法，高效液相

马蓝[Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek]为爵床科植物，广泛分布于我国西南、华南及华东地区，是我国常用药用植物，其叶经加工成干叶后在我国华南地区常作大青叶使用[1]；茎、叶加工成一种深蓝色的粉末入药称为青黛[2]，青黛性寒味咸，具有清热解毒、凉血止血、清肝泻火的功效；根及根茎入药称为南板蓝根[3]，南板蓝根性寒、味苦，归心、胃经，具有清热解毒、凉血、消斑的功效，主治温病发热，发斑，发疹，风热感冒、咽喉肿痛、流行性感冒、脑脊髓膜炎、乙型脑炎、肝炎、肺炎、腮腺炎、丹毒、痈肿、火眼、神昏吐等症[4]。马蓝叶的主要活性成分为靛蓝、靛玉红等吲哚类化合物[5]。靛玉红具有抗肿瘤作用，是治疗慢性粒细胞白血病的有效成分[6]，靛蓝既是一种染料又具有保肝作用[7]。马蓝是一种应用较广泛的药用植物，由于生长周期较长，产量低，过量采挖等因素导致其野生资源急剧减少，市场上充斥着来源于其同科属的伪品，如球花马蓝、广西马蓝等[8]，由于这些伪品的原植物形态与正品马蓝较相似，易于混淆，严重影响临床用药安全。伪品因不含有效成分靛蓝、靛玉红，故不能与正品马蓝混用[8]。为了有效控制马蓝相关药材的质量，笔者建立高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法测定不同地区马蓝根、茎、叶中主要活性成分靛玉红、靛蓝的含量[9-10]。

1 仪器与试药

1.1 仪器 DIONEX P680高效液相色谱仪(美国DIONEX公司)；SHIMADZU UV-1800 分光光度计(日本岛津公司)；十万分之一分析天平(瑞士Metiler Toledo公司)；KQ-250B超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司)。

1.2 试药 靛蓝对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：YM0306SA14，含量≥98%)；靛玉红对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：20121023，含量≥98%)；甲醇(色谱纯)；N，N-二甲基甲酰胺(分析纯，天津市天力化学试剂有限公司)；水为重蒸馏水。样品共15批，见表1，经湖北中医药大学生药教研室张秀桥教授鉴定，为爵床科植物马蓝(Baphicacanthuscusia)的根、茎、叶。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性 采用Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇-水=(75：25)；流速1.0 mL·min-1；柱温25 ℃；检测波长290 nm；进样量20 μL。靛玉红、靛蓝理论板数均>4 000，两组份之间及与其他峰分离度>5。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别精密称取干燥至恒重的靛蓝和靛玉红对照品1.28，1.24 mg，置于25 mL量瓶，加N，N-二甲基甲酰胺溶解并定容，制成每毫升含靛蓝和靛玉红0.051 3，0.049 5 mg的溶液，作对照品储备溶液。分别精密吸取上述各对照品储备溶液1 mL，置5 mL量瓶，加N，N-二甲基甲酰胺至刻度，摇匀，即得各对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 马蓝样品用粉碎机粉碎，过内径0.425 mm(40目)筛。取干燥至恒重样品约75 mg，精密称定，置10 mL量瓶中；加N，N-二甲基甲酰胺适量，超声处理30 min，冷却；加N，N-二甲基甲酰胺至刻度，摇匀，滤过；取续滤液，用内径0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.3 线性关系考察 分别精密量取对照品储备溶液0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0 mL置于10 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀。分别按照“2.1”项色谱条件进行测定，以进样量(μg)为横坐标，色谱峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程，靛蓝：Y=16.954X+0.005 9，r=0.999 7，线性范围是0.051 3～0.820 8 μg；靛玉红：Y=52.978X-0.135 4，r=0.999 9，线性范围是0.049 5～0.792 0 μg。

2.4 精密度实验 分别精密吸取靛蓝和靛玉红对照品溶液20 μL，重复进样6次，测定峰面积。靛蓝、靛玉红峰面积的RSD分别为2.26%和0.86%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性实验 取S6号样品1份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别于0，2，4，6，8，12，24 h进样测定。结果靛蓝和靛玉红的峰面积RSD分别为1.78%和1.90%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好 。

2.6 重复性实验 取S6号样品6份，分别按“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定靛蓝、靛玉峰面积，以外标法计算含量。靛蓝、靛玉峰含量的RSD分别为1.20%和1.57%，表明供试品溶液制备方法重复性良好。

2.7 加样回收率实验 取已知靛蓝、靛玉红含量的S6号样品6份，每份约75 mg，精密称定，分别准确加入靛蓝、靛玉红对照品适量，按“2.2.2”项下制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定靛蓝、靛玉峰面积，计算含量和回收率，结果见表2。

表2 靛蓝和靛玉红加样回收率实验结果Tab.2 Recovery results of indigo and indirubin

2.8 样品含量测定 取不同来源、不同药用部位的样品粉末各75 mg，精密称定，按“2.2.2”项制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定靛蓝、靛玉红峰面积，每份样品重复测定3次，计算含量。结果见表3。

表3 不同产地及不同药用部位马蓝中靛蓝与靛玉红含量

Tab.3 Content of indigo and indirubin inBaphicacanthuscusiafrom different place and medicinal parts

mg·g-1

3 讨论

3.1 检测波长的选择 参照《中华人民共和国药典》2010年版青黛、大青叶中靛蓝、靛玉红的含量测定方法[2]，靛蓝的检测波长为606 nm，靛玉红的检测波长292 nm，但靛蓝在289 nm处有最大吸收[11]，为了便于操作，在同一检测波长下同时测定两种成分，故选择检测波长为290 nm。

3.2 流动相的选择 笔者在本实验中考察了甲醇-水系统和乙腈-水系统，结果两系统均能得到较好的峰形，乙腈-水系统10 min内出峰完全，甲醇-水系统15 min内出峰完全，从经济角度考虑，选择甲醇-水系统更为合适。此外，比较两种比例甲醇-水系统(75：25)及(70：30)，结果以甲醇：水为(75：25)时，峰形更好。

3.3 供试品溶液制备方法的选择 由于靛蓝、靛玉红结构相似，可以采用适当方法同时提取。本文比较3种提取方法即N，N-二甲基甲酰胺超声提取、三氯甲烷超声提取及三氯甲烷索氏提取器提取，结果三氯甲烷超声提取法提取不够完全，提取时间较长，不适合作为本文含量测定提取方法；三氯甲烷索氏提取器提取可以有效提取靛蓝和靛玉红，但其耗时太久，操作繁琐，亦不适合。经过考察溶剂量、提取时间等因素，并参考文献[12]，确定前文供试品制备方法为最佳提取方法。

3.4 不同药用部位中靛蓝与靛玉红的含量分析 马蓝不同药用部位的靛蓝与靛玉红含量存在较大差异，本文实验结果表明来自河南南阳、海南兴隆、华南植物园及重庆的马蓝中靛蓝与靛玉红含量均为叶>茎，广州的马蓝根中的靛蓝与靛玉红含量几乎不能检出。依据相关文献[11，13-15]，发现马蓝根中的靛蓝、靛玉红含量均较低，且远远低于茎叶中含量；由于本实验中供试品溶液制备的取样量均为75 mg，对根而言相对偏低，故来源于广州的S12和S13样品中靛蓝、靛玉红可能由于含量低于检测限度而未能被检出。

3.5 不同产地样品中靛蓝与靛玉红的含量分析 由于马蓝的分布范围较广，不同产地马蓝的靛蓝与靛玉红含量不同。笔者考察马蓝6个来源地样品中，来自海南兴隆(S4号样)马蓝叶中靛蓝含量最高，而来自广西(S6号样)马蓝叶则靛玉红含量最高。不同产地马蓝叶中靛玉红的含量均高于《中华人民共和国药典》2010年版一部大青叶项下含量测定对靛玉红含量(不少于0.020%)的要求，说明我国南方将马蓝叶作为大青叶使用有一定的科学性。此外，还对来自广东和广西的多批球花马蓝叶进行含量测定，结果均未检出靛蓝和靛玉红，进一步验证球花马蓝等伪品不可与马蓝混用。

[1] 《广东中药志》编辑委员会.广东中药志[M].广州：广东科技出版社，1994：153-154.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京：中国医药科技出版社，2010：20-21，185.

[3] 南京中医药大学.中药大辞典(上册)[M].上海：上海科学技术出版社，2006：1726.

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[8] 杨成梓，刘小芬，范世明.药用植物马蓝的资源调查研究[J].中国现代中药，2012，14(3)：33-36.

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[10] 仇济韵，赵士治.高效液相色谱法测定小儿感冒颗粒中靛玉红与靛蓝含量[J].医药导报，2011，30(10)：1353-1355.

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Determination of Indigo and Indirubin in Baphicacanthus cusia from Different Producing Areas and Medicinal Parts by RP-HPLC

CHENG Peipei, XIA Ye, FANG Yu, DA Guozheng, HUANG Jing, ZHANG Xiuqiao

(SchoolofPharmacy,HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430065,China)

Objective To establish a RP-HPLC method for determining indigo and indirubin inBaphicacanthuscusiafrom different producing areas and medicinal parts. Methods The separation was achieved by an Agilent TC-C18Column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) at 25 ℃ using methanol-water (75：25) as mobile phase at a flow rate of 1 mL·min-1.The detection wavelength was 290 nm. Results Indigo had a good linear relationship with peak area at range of 0.051 3-0.820 8 μg (r=0.999 3).The recovery rate was 99.01% and RSD was 1.30% (n=6).Indirubin had a good linear relationship with peak area at range of 0.049 5-0.792 0 μg (r=0.999 9).The recovery rate was 98.88% and RSD was 1.51% (n=6). Conclusion The contents of the two components are obviously different inBaphicacanthuscusiabecause of different places or medicinal parts.The proposed method is simple, rapid and reliable.This method for determination of indigo and indirubin inBaphicacanthuscusiaby RP-HPLC provides a basis for quality control ofBaphicacanthuscusia.

Baphicacanthuscusia；Indigo；Indirubin；Content determination；Chromatography, high performance liquid

2014-06-30

2014-09-23

程佩佩(1988-)，女，湖北仙桃人，在读硕士，主要从事中药资源、品质及开发研究工作。电话：(0)13343581351，E-mail：1173814267@qq.com。

张秀桥(1965-)，女，河北新乐人，教授，博士，主要从事中药品种、质量及资源开发研究工作。电话：(0)13871392318，E-mail：qiaoxzh2000@163.com。

R281.1；R927.2

B

1004-0781(2015)10-1363-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.027