高效液相色谱法同时测定尿液中4种肾脏病常用药物

李 静, 郭展辰, 赵 旭, 马玉花, 韩 萍, 封 顺(新疆大学, 石油天然气精细化工教育部&新疆维吾尔自治区重点实验室, 新疆 乌鲁木齐 830046)

技术与应用

高效液相色谱法同时测定尿液中4种肾脏病常用药物

李 静, 郭展辰, 赵 旭, 马玉花, 韩 萍, 封 顺*
(新疆大学, 石油天然气精细化工教育部&新疆维吾尔自治区重点实验室, 新疆 乌鲁木齐 830046)

建立了一种高效液相色谱同时测定尿液中4种肾脏病常用药物依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米及缬沙坦含量的方法。色谱分离选用WondaSil C18-WR (150 mm×4.6 mm, 5 μm);以10.0 mmol/L乙酸铵溶液(pH 3.90)和乙腈为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,于254 nm波长下检测,18 min内实现了4种药物的分离分析。结果表明依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米、缬沙坦分别在0.15～300 mg/L、0.05～100 mg/L、0.75～750 mg/L、0.05～100 mg/L范围内线性良好,检出限依次为1.38×10-2、7.67×10-3、3.69×10-2、1.16×10-2mg/L,平均加标回收率在89.49%～99.20%之间,相对标准偏差(RSD,n=3)在4.12%～9.44%之间。结果表明该方法样品处理简便、快速,结果准确可靠,为肾脏病患者尿液中的治疗药物浓度监测提供了一种新方法。

高效液相色谱法;依那普利;氨苯蝶啶;呋塞米;缬沙坦;尿液;肾脏病

肾脏病是一种代谢性疾病,近年来随着人们生活水平的提高,其发病率也不断上升。肾脏病后期会导致慢性肾功能衰竭,严重威胁着患者的生命。肾脏病患者需终身服药,目前临床治疗中常用药物主要有依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米、缬沙坦等。但是这4种药物均具有一定的毒性,如依那普利在肾功能不全患者体内容易蓄积,氨苯蝶啶服用过量较易发生高钾血症和肾损害,呋塞米过量会出现肾毒性,缬沙坦过量会出现低血压伴随头晕等症状。因此在治疗过程中需要严格控制剂量,以减少长期服用对人体健康产生的危害。

尿液是唯一能够在无创条件下大量获得的体液,在临床诊断中相对稳定,可在较长的时间内不发生变化,因此近年来引起了人们越来越多的重视[1]。而这4种常用药物中依那普利口服剂量的94%左右以依那普利或其降解产物依那普利拉存在于尿液中。氨苯蝶啶口服剂量约20%会以原形排出至尿液中。口服呋塞米会有88%以原形经肾脏排泄,12%经肝脏代谢由胆汁排泄。缬沙坦以原形药物代谢,70%经胆道排泄,其余通过肾脏排泄。上述4种药物均可在尿液中找到其原形,且其含量与服药剂量有着直接的联系,因此可以通过监测尿液中这4种药物的含量,判定药物用量是否合适,避免药物过量服用。

目前这4种肾脏病常用药物含量测定的方法有高效液相色谱法(HPLC)[2-5]、气相色谱-质谱联用法[6,7]、液相色谱-质谱联用法[8-12]和紫外分光光度法[13-17]等,但上述报道多仅限于一种药物的分离与分析,其原因是这4种药物分子所含官能团种类不同,酸碱性具有较大的不同,导致彼此间疏水性差异较大,对4种药物同时分离与分析具有较大的困难。针对该问题,本文建立了一种高效液相色谱方法用于快速分离分析尿液中这4种肾脏病常用药物,为临床治疗中根据个体情况确定用药剂量提供依据。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

高效液相色谱系统,包括SPD-16紫外-可见检测器和LC Solution工作站(岛津公司)。离心浓缩系统(Speed Vac Concentrator Iss 110)。

马来酸依那普利片(江苏制药股份有限公司);复方利血平氨苯蝶啶片(华润双鹤药业股份有限公司);呋塞米片(江苏亚邦爱普森药业有限公司);缬沙坦胶囊(北京诺华制药有限公司),其分子结构式见图1。

图1 依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米和缬沙坦的分子结构式Fig.1 Structures of enalapril, triamterene, furosemide and valsartan

乙酸铵(天津市盛奥化学试剂有限公司);乙腈(色谱纯);高纯水采自低有机物型超纯水机(FDY2002-SUV,青岛富勒姆科技有限公司);其他试剂均为分析纯。所有试剂均直接使用,未经其他处理。

1.2 色谱条件

色谱柱:WondaSil C18-WR(150 mm×4.6 mm, 5 μm);流动相:A相为10.0 mmol/L的乙酸铵水溶液(pH 3.90), B相为乙腈;梯度洗脱:0～3.00 min, 5%B; 3.01～14.00 min, 5%B～60%B; 14.01～16.00 min, 60%B～80%B; 16.01～18.00 min, 80%B;流速:1.0 mL/min;检测波长:254 nm;柱温:室温;进样体积:20 μL。

1.3 标准溶液的配制

首先采用C18固相萃取柱(WAT03590, 100 mg,沃特世科技有限公司)对市售依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米、缬沙坦进行提纯。提纯后的药品经HPLC分析,以保证其纯度。用10.0 mmol/L乙酸铵水溶液(pH 3.90)准确配成质量浓度分别为3.00×102、1.00×102、7.50×102、1.00×102mg/L的标准储备液,于冰箱冷藏保存,备用。分别用10.0 mmol/L乙酸铵水溶液逐级稀释上述标准储备液,配制含依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米、缬沙坦质量浓度0.15～300 mg/L、0.05～100 mg/L、0.75～750 mg/L、0.05～100 mg/L的系列混合标准溶液。

1.4 样品收集

于新疆维吾尔自治区人民医院体检中心采集样本,共收集晨起尿样3例,志愿者身体健康,一星期之内未服用任何药物,24 h内未饮用含咖啡因的饮品。同时于住院部肾病科收集患者晨起尿样1例。尿样收集后,在2 h内进行处理,4 ℃下3 000g离心10 min,以除去固形物,上清液置于-80 ℃冰箱中保存,备用。

1.5 样品前处理

尿样在室温下解冻,混合均匀,取200 μL上清液于1.5 mL具塞离心管中,加冷丙酮800 μL, 4 ℃静置30 min, 12 000g离心15 min除去蛋白质,将上清液真空冷冻干燥,并用400 μL 10.0 mmol/L乙酸铵水溶液(pH 3.90)复溶作为样品溶液。用10.0 mmol/L乙酸铵水溶液(pH 3.90)逐级稀释10倍,过0.45 μm滤膜,备用。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

4种肾脏病常用药物的分子结构式如图1所示。其中依那普利结构中有仲氨基、叔氨基和羧基,氨苯蝶啶中只有伯氨基和叔氨基,呋塞米中含伯氨基、仲氨基和羧基,而缬沙坦中含叔氨基和羧基,这说明4种药物的疏水性差异较大;同时由于均含有碱性官能团氨基,这会导致色谱峰形出现较为严重的拖尾现象。为改善峰形,提高定量准确性,参照文献[18]所建议的色谱优化过程,首先分别考察这4种药物在不同类型缓冲盐(pH 3.90的磷酸盐和乙酸铵体系)、不同乙腈体积分数(1%～80%)下的等度洗脱色谱行为,以保留时间、峰形等为指标,筛选出最佳缓冲盐及其浓度和乙腈体积分数,然后再对梯度洗脱条件进一步优化,进而筛选出最佳色谱条件(见1.2节)。在此优化色谱条件下,4种药物的典型HPLC色谱图列于图2。

表1 4种药物的线性方程、相关系数、检出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L. LOD:S/N=3; LOQ:S/N=10.

2.2 线性范围及检出限

不同质量浓度的4种药物的混合标准溶液在优化后的色谱条件下进行分析(n=3),以质量浓度-峰面积平均值作图,制作定量标准曲线,以S/N=3确定检出限,S/N=10确定定量限。由表1可以看出,4种药物的线性拟合相关系数r均大于0.995,线性良好,可以用于准确定量。同时检测线性范围达到4～5个数量级,适用浓度范围广。

图2 (a)4种药物混合标准溶液、(b)加标正常人尿样和 (c)患者尿样的HPLC典型色谱图Fig.2 Typical HPLC chromatograms of (a) a standard mixture of the four drugs, (b) spiked urine sample and (c) a patient urine sample Conditions: WondaSil C18-WR (150 mm×4.6 mm, 5 μm); flow rate, 1.0 mL/min; detection wavelength, 254 nm; mobile phase A, 10 mmol/L CH3COONH4 solution (pH 3.90); B, CH3CN; gradient program: 0-3.00 min, 5%B; 3.01-14.00 min, 5%B-60%B; 14.01-16.00 min, 60%B-80%B; 16.01-18.00 min, 80%B.Peak identification: 1. enalapril; 2. triamterene; 3. furosemide; 4. valsartan.

2.3 回收率、精密度及尿样测定

为验证方法的可靠性,首先对3例健康志愿者的尿液样本采用1.5节的方法进行处理,分别在上述3个尿样中添加3个浓度水平的目标物,并在优化的色谱条件下进行分离分析,所得HPLC典型色谱图见图2b;对3个尿样中同一药物在同一加标浓度水平的数据求平均值,并计算回收率和精密度。由表2可知依那普利的平均回收率为93.39%,氨苯蝶啶的平均回收率为99.20%,呋塞米的平均回收率为89.49%,缬沙坦的平均回收率为98.27%, RSD均小于10%,表明方法的重现性良好,所建立的方法可用于实际样品中4种药物的分离分析。

表2 4种药物在尿样中的加标回收率和相对标准偏差(n=3)

*P<0.05.

2.4 实际患者尿样的测定

在新疆维吾尔自治区人民医院住院部肾病科随机采集晨尿样本1例,在优化的色谱条件下进行分析,从图2c中仅能观察到缬沙坦的特征峰,说明该患者仅口服过缬沙坦,该结果与临床医嘱一致。为进一步验证结果的可靠性,对该例尿样进行加标回收率测定,3次测定的平均加标回收率为97.10%, RSD为2.33%,表明方法的重现性良好,所建立的方法可用于实际样品中缬沙坦的分离分析。

3 结论

本文采用传统的反相高效液相色谱法实现了对尿液中4种疏水性差异较大,含有碱性官能团的肾脏病常用药物依那普利、氨苯蝶啶、呋塞米及缬沙坦的同时分离。方法简便,可靠,为监测肾脏病患者尿液中常用药物的浓度提供了一种快速检测方法。

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Simultaneous determination of four drugs for kidney diseases in urine by high performance liquid chromatography

LI Jing, GUO Zhanchen, ZHAO Xu, MA Yuhua, HAN Ping, FENG Shun*

(KeyLaboratoryofOil&GasFineChemicals,MinistryofEducationandXinjiangUyghurAutonomousRegion,XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was proposed for the simultaneous determination of four drugs for kidney disease, enalapril, triamterene, furosemide and valsartan. After proteins being removed by acetone precipitation method, freeze drying and redissolving in mobile phase, the urine samples were analyzed by HPLC. Chromatographic separation was performed on a WondaSil C18-WR (150 mm×4.6 mm, 5 μm) in gradient elution mode using 10.0 mmol/L ammonium acetate aqueous solution (pH 3.90) and acetonitrile as mobile phases at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 254 nm. Under the optimized conditions, good linearities were obtained in the range of 0.15-300 mg/L, 0.05-100 mg/L, 0.75-750 mg/L, 0.05-100 mg/L, and the detection limits were 1.38×10-2, 7.67×10-3, 3.69×10-2, 1.16×10-2mg/L for enalapril, triamterene, furosemide and valsartan, respectively. The recoveries were in the range of 89.49%-99.20% with the relative standard deviations (RSDs) among 4.12%-9.44%. The method is simple, accurate and effective, and the results showed the method is applicable for the analysis of the four drugs for kidney diseases in real urine samples.

high performance liquid chromatography (HPLC); enalapril; triamterene; furosemide; valsartan; urine; kidney disease

10.3724/SP.J.1123.2015.07022

新疆大学2014年国家大学生创新创业实训项目(201410755015).

2015-07-21

O658

:A

:1000-8713(2015)11-1210-04

*通讯联系人.Tel:(0991)8582087,E-mail:fengshunxd@hotmail.com.