粗针督脉平刺治疗缺血性面瘫大鼠的机制探讨

虞彬艳,宣丽华,吕善广,万意佳,韦英姿,李红玉

(1.浙江省中医院,杭州 310006;2.浙江中医药大学,杭州 310053)

·动物实验·

粗针督脉平刺治疗缺血性面瘫大鼠的机制探讨

虞彬艳1,宣丽华1,吕善广2,万意佳2,韦英姿2,李红玉2

(1.浙江省中医院,杭州 310006;2.浙江中医药大学,杭州 310053)

目的观察粗针督脉平刺对缺血性面瘫大鼠的治疗效果,初步探讨产生疗效的可能机制。方法将60只Wistar 大鼠随机分为A组(粗针平刺组)、B组(基础西药组)、C组(空白对照组)和D组(假手术组),每组15只。所有大鼠均采用改良血管栓塞法建立缺血性面瘫模型。在治疗期间对各组大鼠进行面神经功能缺损评分,A组于造模后1 d选取神道穴平刺,留针4 h,每日1次,共治疗14 d;B组于造模后1 d予强的松灌胃、维生素B12腹腔注射治疗,每日1次,共治疗14 d;C组与D组不进行治疗。分别在造模后第3、7、14天随机选取4只,采用免疫组织化学法进行面神经伴行固有血管组织HIF-1α蛋白测定,酶联免疫吸附测定法检测血清NO,放射免疫法检测血清ET含量。结果治疗7 d后,A组和B组神经功能缺损评分逐渐升高,与同组造模后比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。A组和B组治疗7 d后神经功能缺损评分与C组和D组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。C组治疗7 d后神经功能缺损评分与D组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)。A组和B组治疗14 d后神经功能缺损评分与C组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。B组和C组治疗14 d后神经功能缺损评分与D组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。A组治疗14 d后神经功能缺损评分与同组治疗7 d后相比较,差异具有统计学意义(P＜0.05)。A组、B组和C组治疗3、7、14 d后HIF-1α MOD值与D组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。A组和B组治疗3、7 d后HIF-1α MOD值与C组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。A组和B组治疗3、14 d后HIF-1α MOD值与同组治疗7 d后比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。A组和B组治疗3、7 d后血清NO含量与D组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。A组和B组治疗7 d后血清NO含量与同组治疗3 d后比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。A组、B组和C组治疗3、7 d后血清ET含量与D组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。A组和B组治疗7 d后血清ET含量与同组治疗3 d后比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论粗针督脉平刺能够有效促进缺血性面瘫大鼠的恢复,其产生疗效机制可能是通过调控组织HIF-1α的表达及血清NO、ET含量。

针刺疗法;面神经麻痹,周围性;缺氧诱导因子;一氧化氮;内皮素;大鼠

面瘫是以颜面表情肌运动功能障碍为主要特征的一种临床常见病和多发病,分为中枢性面瘫和周围性面瘫。周围性面瘫临床表现为一侧面部板滞、麻木、松弛,不能皱额、闭目、耸鼻、鼓腮等动作,口角向健侧歪斜,病侧露睛流泪,额纹消失,鼻唇沟平坦,少数患者初起有耳后、耳下及面部疼痛等。周围性面瘫中又以面神经炎最为常见,现代医学认为本病的发作,是由于局部营养神经的血管因受寒、炎症、免疫异常、病毒感染等[1]刺激引起痉挛, 面神经因缺血而水肿, 同时又受到面神经管的限制, 使血管受压而导致缺血加重, 因而产生面瘫[2]。近代医学对缺血性疾病的研究发现,在缺血疾病的产生的过程中与低氧诱导因子-1α (HIF-1α)以及血清一氧化氮(NO)和内皮素(ET)等因子有密切的关联[3-6]。本研究在建立符合因缺血而导致的面瘫模型基础上,通过粗针督脉平刺进行干预,观察督脉平刺对面瘫的治疗效果,并初步探讨其治疗的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用60只SPF级健康雄性Wistar大鼠,体重为(220±20)g,购于中国科学院上海实验动物中心。

1.2 主要试剂和设备

NO ELISA试剂盒(瑞士 Bachem公司),兔抗大鼠HIF-lα单克隆抗体、免疫组织化学SABC试剂盒(美国Bioworld Technology公司),组化试剂盒DAB显色剂(DAKO),0.40 mm×30mm 针灸针(江苏省吴江市佳辰针灸器械有限公司),全波长酶标仪 Spectra Max M4(美国Molecular Devices公司),Image-Proplus图像分析系统(美国Media Cybernetics公司)。

1.3 动物分组及模型建立

将选用的60只大鼠随机分为A组(粗针平刺组)、B组(基础西药组)、C组(空白对照组)和D组(假手术组),每组15只。除D组外,其余各组大鼠均用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉后,在王杰等[7]制作缺血性面瘫大鼠模型的基础上进行简化改良,于右颈侧切口,切除部分舌骨,暴露颈外动脉,用不可吸收手术缝合线结扎颈外动脉,参照Simone 10[8]进行神经功能缺损评分,介于 3～5分则判定为造模成功。D组大鼠仅在血管附近软组织稍作钝性破坏,压迫止血后,予以创口缝合。

各组大鼠均于造模后第1天开始治疗。

A组取大鼠督脉第5胸椎棘突下神道穴,沿督脉经向下平刺直至针根部,留针4 h。每日1次,共治疗14 d。

B组采用药物治疗。强的松片予以灌胃,每100 g体重给药剂量分别为,前5 d每日0.05 mg,6～8 d每日 0.03 mg,9～11 d每日 0.016 mg,12～14 d每日0.008 mg;维生素B12予以腹腔注射给药,每100 g体重给药剂量为每日0.83 μg。

C组和D组均在正常情况下饲养,不做任何处理。

1.5 检测方法

1.5.1 行为学观察

每日观察各组大鼠行为学变化,参照 Simone 10分法对其神经功能进行评分,每星期均予以记录。

采用学术报告形式的出科考核方式可以激发学生的学习兴趣，拓宽了知识面，通过自行查阅资料等方式、既可以加深对基础知识的理解和记忆，又可以提高自身分析、解决临床实际问题的能力，达到提升临床思维的目的。通过报告汇报，提高自信心，增强勇气、锻炼其语言表达能力和沟通能力。带教教师通过指导、修改、分析学生学术报告，及时了解最新知识动态，从而达到教学相长的初衷。

1.5.2 指标检测

每组在治疗后第3、7、14天随机选取4只大鼠,截取面神经伴行固有血管,运用免疫组织化学法检测HIF-1α阳性细胞的表达;采静脉血,置于 EP管中用台式冷冻离心机离心,留取血清,保存于-80°冰箱备用,采用酶联免疫吸附测定(ELISA法)检测血清NO含量,采用放射性免疫法(RIA法)检测ET含量。

1.6 统计学方法

采用 SPSS 13.0 软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA);组间两两比较,方差齐性时采用LSD检验,方差不齐时采用 Dunnett’s T3检验。以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组治疗前后面神经功能缺损评分比较

由表1可见,A组、B组和C组造模后神经功能缺损评分均为3～5分,提示造模成功。治疗7 d后,A组和 B组神经功能缺损评分逐渐升高,与同组造模后比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。A组和B组治疗7 d后神经功能缺损评分与C组和D组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。C组治疗7 d后神经功能缺损评分与D组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。A组和B组治疗14 d后神经功能缺损评分与C组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。B组和C组治疗14 d后神经功能缺损评分与D组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。A组治疗14 d后神经功能缺损评分与同组治疗7 d后比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组治疗前后面神经功能缺损评分比 (±s,分)

表1 各组治疗前后面神经功能缺损评分比 (±s,分)

注:与同组造模后比较1)P＜0.01;与D组比较2)P＜0.05;与A组比较3)P ＜0.05;与C组比较4)P＜0.05;与同组治疗7 d后比较5)P＜0.05

组别 n 造模后 治疗7 d后 治疗14 d后A组 15 4.08±0.40 7.91±0.541)2)4) 9.48±0.424)5)B组 15 4.21±0.57 8.67±0.621)2)3)4) 8.84±0.472)4)C组 15 4.04±0.54 5.35±0.502) 5.93±0.582)D组 15 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00

2.2 各组治疗前后HIF-1α MOD值比较

由表2可见,A组、B组和C组治疗3、7、14 d 后HIF-1α MOD值与D组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。A组和B组治疗3、7 d后HIF-1α MOD值与C组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。A组和B组治疗3、14 d后HIF-1α MOD值与同组治疗7 d后比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

表2 各组治疗前后HIF-1α MOD值比较 (±s,×10-3)

表2 各组治疗前后HIF-1α MOD值比较 (±s,×10-3)

注:与D组比较1)P＜0.01;与C组比较2)P＜0.05;与同组治疗7 d后比较3)P＜0.05

组别 n 治疗3 d后 治疗7 d后 治疗14 d后A组 15 5.32±1.271)2)3) 9.75±2.261)2) 2.04±0.331)3)B组 15 6.25±2.671)2)3) 8.89±1.421)2) 1.44±0.451)3)C组 15 2.78±0.661) 3.13±0.841) 4.17±0.711)D组 15 0.36±0.37 0.89±0.23 0.38±0.21

2.3 各组治疗前后血清NO含量比较

由表3可见,A组和B组治疗3、7 d后血清NO含量与 D组比较,差异均具有统计学意义(P＜0.01)。A组和B组治疗7 d后血清NO含量与同组治疗3 d后比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05))。

表3 各组治疗前后血清NO含量比较 (±s,μmol /L)

表3 各组治疗前后血清NO含量比较 (±s,μmol /L)

注:与D组比较1)P＜0.01;与同组治疗3 d后比较2)P＜0.05

组别 n 治疗3 d后 治疗7 d后 治疗14 d后A组 15 205.63±47.651)168.44±47.581)2)112.57±39.51 B组 15 190.24±53.891)152.41±38.631)2) 94.78±46.34 C组 15 150.22±33.65 123.72±27.15 109.48±38.57 D组 15 112.08±38.09 99.25±41.53 108.67±56.39

2.4 各组治疗前后血清ET含量比较

表4 各组治疗前后血清ET含量比较 (±s,pg/mL)

表4 各组治疗前后血清ET含量比较 (±s,pg/mL)

注:与D组比较1)P＜0.01;与同组治疗3 d后比较2)P＜0.05

组别 n 治疗3 d后 治疗7 d后 治疗14 d后A组 15 99.28±11.171) 89.47±10.131)2)58.51±22.96 B组 15 108.48±16.141) 95.26±21.391)2)52.50±14.28 C组 15 135.39±13.711) 118.68±21.041) 67.84±10.98 D组 15 47.34±14.22 56.07±18.16 49.55±19.08

由表4可见,A组、B组和C组治疗3、7 d后血清ET含量与D组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05)。A组和B组治疗7 d后血清ET含量与同组治疗3 d后比较,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

传统中医疗法在漫长的医疗实践中积累了丰富的临床经验,其中针灸治疗面瘫疗效毋庸置疑,粗针督脉平刺以中医学理论为基础,延承传统针灸疗法的优势和特点,有报道[9-12]显示其能促进面瘫患者面肌功能的恢复,明显缩短病程及改善预后。因此,鉴于目前临床应用粗针督脉平刺疗法所取得的疗效和成果,对其相关作用机制的研究成为目前研究的关键。

根据目前对面瘫的病因病机的研究,大多数学者认为面瘫的发病机制与微循环关系密切,其中以HIF-1α、NO和ET在缺血性疾病中研究甚多。

HIF-1α是在缺氧条件下介导哺乳动物细胞中低氧反应的一种转录调节因子,一些生理条件下,如缺氧、局部缺血、创伤、炎症等均可诱导细胞产生HIF-1α。在动物实验中,应用HIF-1α已成功诱导了多种具有促血管生成活性的因子的表达,改善了缺血组织的血供[13-15],同时局部缺血缺氧也是通过上调HIF-1α诱导血管新生的主要因素[16]。

NO和ET是公认较为活跃的血管调节因子,ET是最强烈的缩血管因子,而 NO则为一种血管舒张因子,二者存在一定的动态平衡,以维持血管舒缩功能和血液流动性,一旦这种平衡被破坏,将对血管张力产生很大影响[17-22]。NO从内皮释放后在细胞外液中弥散,并与血管平滑肌上受体结合,引起舒血管效应。而ET是迄今为止所知的最强的缩血管物质,缺血缺氧是 ET 大量释放的最主要因素之一,使小动脉、小静脉收缩,从而改变组织的血液供应状况[23-26]。

本实验结果显示,大鼠在缺血性面瘫造模后,面神经缺损评分明显降低,血管内皮 HIF-1α的表达和血清NO含量均有不同程度的升高,血清ET含量减少,有可能说明这3类信息因子在面瘫发病后均参与改善缺血状态。本实验初步发现,治疗后粗针督脉平刺组大鼠神经缺损评分升高,其血管内皮HIF-1α表达和血清NO含量明显增高,而血清ET含量明显减少。因此初步认为粗针督脉平刺对缺血性面瘫大鼠面肌功能的恢复有良好的改善作用,并且能够影响HIF-1α、NO和ET这3类信息因子的表达,其作为一种有效治疗面瘫的方法,可能是通过促进组织HIF-1α的表达,调控血清NO、ET含量而产生疗效。

[1]俞光岩,顾晓明,蔡志刚.周围性面瘫[M].北京:人民卫生出版社, 2005:68-69.

[2]李坚将,刘辉.针灸治疗面瘫及对口唇、甲襞微循环的影响[J].上海针灸杂志,2001,20(5):16-18.

[3]Granger JP, Abram S, Stec D, et al. Endothelin, the kidney, and hypertension[J]. Curr Hypertens Rep, 2006, 8(4):298-303..

[4]Li D, Wang X, Fu Z, et al. Tibetan patients with essential hypertension caused by underlying oxidative metabolism dysfunction and depressed nitric oxide synthesis[J]. Chin Med J (Engl), 2003, l16(2):309-311.

[5]吴学苏,李鸣,陆源源,等.针刺对急性高血压大鼠一氧化氮、内皮素、血管紧张素及肾素的影响[J].中国中医药信息杂志,2008, 15(7):41-42.

[6]吴远华,朱广旗,林兴友,等.针刺曲池、太冲对高血压病患者血中ET和 ACE的影响及疗效探讨[J].中国中西医结合杂志,2004,24 (12):1080-1083.

[7]王杰,戴春富,赵晖,等.大鼠缺血性面神经瘫痪动物模型的建立[J].临床耳鼻咽喉科杂志,1999,13(10):464-465.

[8]de Faria SD, Testa JR, Borin A, et al. Standardization of techniques used in facial nerve section and facial movement evaluation in rats[J]. Braz J Otorhinolaryngol, 2006, 72(3):341-347.

[9]宣丽华,虞彬艳,高宏,等.粗针神道穴平刺治疗面神经炎临床多中心研究[J].中华中医药学刊, 2012,30(1):18-20.

[10]虞彬艳,宣丽华,吴翔,等.粗针神道穴平刺与传统针刺治疗不同损伤程度面神经炎的比较研究[J].中国中医药科技,2012,19(2): 99-101.

[11]宣丽华,刘祝贺,莫晓枫,等.粗针神道穴平刺对面神经炎患者瞬目反射的影响[J],中华中医药学刊,2010,28(7):1428-1430.

[12]宣丽华,王丽莉,侯群,等.粗针神道穴平刺促进面神经炎面肌功能恢复的研究[J].中国中医药科技,2007,14(1):6-7.

[13]曲伟栋,赵华强.低氧条件下HIF-1促进血管生成的研究进展[J].口腔医学研究,2009,25(2):234-236.

[14]陆蕴松,高忠礼,刘光耀.低氧诱导因子-1对血管内皮生长因子的调控[J].中国老年学杂志,2009,29(7):905-907.

[15]Wenger RH. Cellular adaptation to hypoxia: O2-sensing protein hydroxylases, hypoxia-inducible transcription factors, and O2-regulated gene expression[J]. FASEB J, 2002,16(10):1151-1162.

[16]Jin KL, Mao XO, Nagayama T, et al. Induction of vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor-1alpha by global ischemia in rat brain[J].Neuroscience,2000,99(3):577-585.

[17]Everson WV, Smart EJ. Influence of caveolin, cholesterol, and lipoproteins on nitric oxide synthase:implications for vascular disease[J]. Trends Cardiovasc Med, 2001, 11(6):246-250.

[18]林孟戈,刘晨,李智文.急性脑梗死患者血浆超敏 C-反应蛋白、一氧化氮及一氧化氮合酶水平的变化及其相关性[J].山西医科大学学报,2011,42(2):141-144.

[19]王春娟,薛连壁.缺血性脑卒中与 NO、SOD 关系研究进展[J].脑与神经疾病杂志,2007,15(5):391-394.

[20]Barone FC, Globus MY, Price WJ, et al. Endothelin levels increase in rat focal and global ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 1994, 14(2):337-342.

[21]Alioğlu Z, Orem A, Bülbül I, et al. Evaluation of plasma endothelin-1 levels in patients with cerebral infarction[J]. Angiology, 2002, 53(1): 77-82.

[22]Yamashita K, Kataoka Y, Yamashita YS, et al. Glial endothelin/nitric oxide system participates in hippocampus CA1 neuronal death of SHRSP following transient forebrain ischaemia[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol Suppl, 1995, 22(1):S277-278.

[23]Montrezor LH, Piccinato CA, Collares CV, et al. Effects of angiotensin II, atrial natriuretic peptide and endothelin-1 on proliferation and steroidogenic output of bovine granulosa cells cultured in a chemically defined system[J]. Anim Reprod Sci, 2015,(152):8-16.

[24]Frykman PK, Cheng Z, Wang X, et al. Enterocolitis causes profound lymphoid depletion in endothelin receptor B- and endothelin 3-null mouse models of Hirschsprung-associated enterocolitis[J]. Eur J Immunol, 2015, 45(3):807-817.

[25]Smith TP, Schlenz AM, Schatz JC, et al. Modulation of pain in pediatric sickle cell disease: understanding the balance between endothelin mediated vasoconstriction and apelin mediated vasodilation[J]. Blood Cells Mol Dis, 2015, 54(2):155-159.

[26]Kenna JG, Stahl SH, Eakins JA, et al. Multiple compound-related adverse properties contribute to liver injury caused by endothelin receptor antagonists[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2015, 352(2):281-290.

·书 讯·

《尤益人针灸临床经验集》简介

针灸经络研究所李丽会主治医师主编的《尤益人针灸临床经验集》最近由上海科学技术出版社出版了。该书为名老中医尤益人从医近70年针灸临床及学术经验总结。全书分4个部分,第1部分简要介绍了尤老的生平; 第2部分介绍了尤老的学术经验;第3部分为医案医话;第4部分为尤老与临床各学科协作,在中西医结合领域所做的贡献。全书内容注重于临床实践的总结,特别是对尤老擅长诊疗的病症,不但总结其理法,并对处方配穴规律、针灸操作注意事项等做了精当的阐述,此外还列举大量临床验案,对临床有重要指导价值。该书可供中医针灸临床医生,或中医其他学科医生参考阅览。

该书售价25元(包含邮寄挂号费5元)。欲购者请汇款至《上海针灸杂志》编辑部,上海市宛平南路650号,邮编200030。

Exploration of the Mechanism of Treatment of Rat Ischemic Facial Paralysis by Transverse Insertion of Thick Needles into the Du Meridian

YU Bin-yan1,XUAN Li-hua1, LV Shan-guang2, WAN Yi-jia2, WEI Ying-zi2, LI Hong-yu2. 1.Zhejiang Hospital of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310006,China; 2.Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou 310053, China

ObjectiveTo investigate the efficacy of transverse insertion of thick needles into the Du meridian in treating rat ischemic facial paralysis and preliminarily explore the possible mechanism by which it produces a therapeutic effect.MethodsSixty Wistar rats were randomly allocated to groups A (transverse insertion of thick needles), B (basic Western drugs), C (blank control) and D (sham operation), 15 rats each. A rat model of ischemic facial paralysis was made using a modified vascular occlusion method in all the rats. Facial nerve deficits were scored in every group of rats during treatment. At 1 day after model making, group A was treated by transverse insertion into point Shendao and 4-hour retention of needle, once daily, for a total of 14 days; group B was treated by an oral gavage of prednisone and intraperitoneal injection of vitamine B12, once daily, for a total of 14 days. Groups C and D were not treated. In 4 rats randomly chosen at 3, 7 or 14 days after model making, facial nerve concomitant intrinsic vascular tissue HIF-1αprotein was measured by an immunohistochemical method; serum NO, by enzyme-linked immunosorbent assay; serum ET content, by radioimmunoassay.ResultsAfter 7 days of treatment, the neurological deficit score increased gradually in groups A and B and there was a statistically significant difference compared with after model making in the two groups (P＜0.01). After 7 days of treatment, there was a statistically significant difference in the neurological deficit score in groups A and B compared with groups C and D (P＜0.05) and between groups C and D (P＜0.05). After 14 days of treatment, there was a statistically significant difference in the neurological deficit score between group A or B and group C (P＜0.05) and between group B or C and group D (P＜0.05). In group A, there was a statistically significant difference in the neurological deficit score after 14 days of treatment compared with after 7 days of treatment (P＜0.05). After 3, 7 and 14 days of treatment, there was a statistically significant difference in HIF-1αMOD value in groups A , B and C compared with group D (P＜0.01). After 3 and 7 days of treatment, there was a statistically significant difference in HIF-1αMOD value between group A or B and group C (P＜0.05). In groups A and B, there was a statistically significant difference in HIF-1αMOD value after 3 and 14 days of treatment compared with after 7 days of treatment (P＜0.05). After 3 and 7 days of treatment, there was a statistically significantdifference in serum NO content between group A or B and group D (P＜0.01). In groups A and B, there was a statistically significant difference in serum NO content after 7 days of treatment compared with after 3 days of treatment (P＜0.05). After 3 and 7 days of treatment, there was a statistically significant difference in serum ET content in groups A , B and C compared with group D (P＜0.05). In groups A and B, there was a statistically significant difference in serum ET content after 7 days of treatment compared with after 3 days of treatment (P＜0.05).Conclusions Transverse insertion of thick needles into the Du meridian can effectively promote rat’s recovery from ischemic facial paralysis. The mechanism by which it produces a therapeutic effect may be regulating the expression of tissue HIF-1α and the NO and ET contents of serum.

Acupuncture therapy; Facial paralysis, peripheral; Hypoxia inducible factor; Nitric oxide; Endothelin; Rats

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2015.03.0256

1005-0957(2015)03-0256-04

2014-10-12

浙江省自然科学基金项目(LY12H27007)

虞彬艳(1985 - ),女,主治医师

宣丽华(1960 - ),女,教授,博士生导师,E-mail:xlh1083@ 163.com