山羊副流感病毒3型JS2013分离株对豚鼠致病性的研究

王钟毓，李文良，郝 飞，毛 立，杨蕾蕾，张纹纹，江杰元

（江苏省农业科学院兽医研究所，江苏 南京 210014）

山羊副流感病毒3型JS2013分离株对豚鼠致病性的研究

王钟毓，李文良，郝 飞，毛 立，杨蕾蕾，张纹纹，江杰元⋆

（江苏省农业科学院兽医研究所，江苏 南京 210014）

为了探究CPIV3 JS2013分离株的致病性，本试验采用豚鼠研究该病毒在动物体内的复制及机体组织病理损伤等情况。结果表明，攻毒后2 d攻毒组的豚鼠开始出现临床症状。RT-PCR检测攻毒后第3～7天出现病毒血症，攻毒后第3～14天均可以从肺组织中检测到病毒。剖检观察攻毒组豚鼠，豚鼠肺出现实变、淤血、肿大，病理组织学检测发现攻毒组豚鼠肺组织出现肺泡间隔增宽、肺泡融合、炎性细胞浸润等变化。HI试验表明豚鼠感染后第5天开始出现血凝抑制抗体，之后持续升高至21 d仍保持较高的水平。

CPIV3；致病性；豚鼠

副流感病毒3型（parainfluenza virus type 3，PIV3）是副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亚科（Paramyxovirinae）呼吸道病毒属（Respirovirus）的单股负链RNA病毒，是人和动物呼吸道重要病原。其成员包括人副流感病毒1型和3型（HPIV1、 HPIV3）、仙台病毒、牛副流感病毒3型（BPIV3）。2014年本实验室从表现为严重呼吸道症状的山羊临床病料中首次成功分离鉴定出一株山羊源副流感病毒3型，通过基因组测序，病原学特性研究证实其不同于其他副流感病毒3型，将其命名为山羊副流感病毒3型（Caprine parainfluenza virus type 3，CPIV3）。PIV3广泛存在于自然界，可引起各年龄阶段儿童或幼龄哺乳动物发病，导致小儿或幼龄动物轻重不等的呼吸道感染，如感冒、咳嗽、重症喉气管支气管炎、毛细支气管炎和肺炎。已有研究报道豚鼠作为动物模型研究人副流感病毒3型和牛副流感病毒3型感染后呼吸道反应性和气道炎症，因此本研究使用豚鼠研究CPIV3 JS2013株的致病性，探寻豚鼠作为CPIV3试验动物感染模型的可能性，为今后进一步研究CPIV3感染过程提供依据。

1 材料与方法

1.1 病毒与试剂 CPIV3 JS2013分离株由本实验室分离鉴定，将CPIV3 JS2013毒株接种MDBK细胞进行两次蚀斑纯化并连续传代增殖培养。

MDBK传代细胞购自中国兽医药品监察所；Transzol UP试剂、一步法RT-PCR试剂盒、Taq酶购自北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司。

1.2 动物分组及病毒感染程序 40只清洁级豚鼠用于本次的CPIV3 JS2013株人工感染试验。整个试验期间，所有豚鼠都被隔离培育在受控的笼子。豚鼠购回后，先隔离饲养7 d左右，使其适应新的环境，以排除应激的因素。之后将试验豚鼠随机分为两组，一组含有16只试验豚鼠作为感染组（CC），另外一组含有16只试验豚鼠作为空白对照组（NC）。感染组试验豚鼠通过滴鼻接毒TCID50为10-6.55/100μL的CPIV3 JS2013株病毒液300 μL每只。阴性对照豚鼠通过滴鼻接种相同量的MDBK细胞培养液上清。之后每日观察试验豚鼠的临床症状，尤其是试验豚鼠的身体状态和呼吸道疾病相关症状。在感染后第1、3、5、7、11、14、17、21天，通过安乐死每日处死2只感染组试验豚鼠和2只对照组试验豚鼠，摘取试验动物的脾、肺和气管组织，并对试验豚鼠进行心脏采血分离血清，所有获得的试验豚鼠的病料均置于-20℃保存备用。将所有取得的组织分成3份，分别进行病毒分离、RT-PCR检测和病理组织学检测。

1.3 RTT--PPCCRR检测与病毒分离 采用Transzol UP试剂提取鼻拭子、血清样品总RNA，RT-PCR扩增CPIV3 M基因检测病毒血症和排毒情况，RT-PCR总体积20 μL，其中2×R-Mix Buffer 10 μL，上下游引物各0.5 μL（F 5’-AGTGATCTAGATGATGATCCA-3’，R 5’-GTTATTGATCCAATTGCTGT-3’），E-Mix 0.4 μL，RNA模版4 μL，无Rnase水补足至20 μL。扩增程序：45℃ 反转录40 min；94℃ 5 min；94℃30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃ 10 min。反应结束后取PCR产物于1.2%的琼脂糖凝胶中电泳检测，并拍照记录。

按照报道的方法将阳性样品在MDBK细胞上进行病毒分离。

1.4 病理学检测 按病毒感染程序处死试验豚鼠后，将获取的感染组及空白组实验豚鼠各组织样品固定于4%中性福尔马林缓冲溶液中，48 h后进行石蜡包埋、切片等进行组织病理学检测。

1.5 血凝抑制试验 将按病毒感染程序分离得到的试验豚鼠血清按标准程序进行血凝抑制试验：在96孔微量血凝板的第一行每孔先加入25 μL生理盐水，然后加入待检试验豚鼠血清进行1:2连续倍比稀释，然后每孔加入25 μL 4单位抗原（根据第二章对JS2013株分离鉴定时所测的病毒血凝效价确定），在37℃恒温培养箱孵育30 min后，加入1%的豚鼠红细胞悬液25 μL，在37℃恒温培养箱孵育40 min后判定试验结果，HI抗体滴度为能完全抑制红细胞凝集的血清的最高稀释倍数（HI抗体滴度≤3log2判定为阴性，≥4log2判定为阳性）。

2 结果与分析

2.1 临床症状 感染组试验豚鼠在攻毒后第2天开始有个别出现流鼻涕、打喷嚏和眼分泌物增多的症状，第4天开始普遍出现较为严重的呼吸道症状，并出现腹式呼吸，症状一直持续到第14天，感染组豚鼠普遍出现精神倦怠、食欲减退和不喜走动的症状。空白组试验豚鼠则无明显临床症状。感染组试验豚鼠在接毒后第2～6天、第11天每天分别死亡1只，而空白组试验豚鼠并没有出现死亡，说明CPIV3 JS2013株对豚鼠有较强的致病性。

2.2 病毒的RTT--PPCCRR检测与病毒分离 将采集的临床样本处理后，抽提总RNA，RT-PCR扩增CPIV3 M基因。结果显示，攻毒后3 d可以检出病毒血症，持续到攻毒后第7天，攻毒后第3～14天，RT-PCR均可以从肺组织匀浆中检测到排毒（见表1）。空白组检测均为阴性。将检测为阳性的条带回收后送测序公司测序，结果显示扩增毒株为CPIV3 JS2013株。阳性样品经MDBK细胞分离能产生细胞病变，RT-PCR检测为CPIV3 JS2013株。

表1 动物排毒情况和病毒血症Table1 Viral RNA of nasal swab and viremia

2.3 试验豚鼠解剖学病理变化 感染组试验豚鼠肺脏解剖学病理变化主要集中在接毒后第2～11天，肺组织表现为暗红色淤血、不规则的实变等。在接毒后的第3～7天感染组试验豚鼠几乎整个肺脏都呈现为实变和膨胀不全；接毒后的第7～14天可见肺脏膨胀逐减减轻；到第21天可见肺脏病变更不明显，说明感染组试验豚鼠在逐减恢复中（图1）。同时感染组试验豚鼠接毒后第2～7天，解剖可见脾脏与空白组试验豚鼠相比肿大明显（图1）。

2.4 试验豚鼠组织病理学检测 病理组织学检测结果表明感染组试验豚鼠肺脏主要组织病理学变化表现为肺泡间隔增宽、纤维性渗出、巨噬细胞浸润、实变和代偿性肺气肿。在人工感染后第3天，感染组试验豚鼠肺脏都表现出了肺泡间隔增宽变化；人工感染后第5天，感染组试验豚鼠肺脏表现为局部纤维素渗出及充血；人工感染后第7天，感染组试验豚鼠肺脏表现为代偿性肺气肿；人工感染后第11天，感染组试验豚鼠肺脏可见间质性肺炎变化；空白组试验豚鼠肺脏未见病理变化（图2）。

2.5 血凝抑制试验 取本试验中感染组和空白组试验豚鼠第0、3、5、7、13、21天的血清进行血凝抑制试验。测得感染组试验豚鼠血凝抑制效价分别为1:20、1:23、1:24、1:26、1:25、1:24，而空白组试验豚鼠则一直为1:20。血凝抑制试验的结果说明JS2013株对豚鼠有较强的致病性。

3 讨论

研究表明，PIV3可引起人和相关动物呼吸道疾病，HPIV1、HPIV3是导致人类上下呼吸道感染的重要病原体；BPIV3是引起牛呼吸道疾病的主要病原，其引起的临床症状差异较大，可以是表现严重的呼吸道感染，也可以为无症状的亚临床感染。到目前为止，只有少数关于PIV3在羊群感染情况的报道，多为血清学抗体检测，并未对其病原进行鉴定。本实验室2014年首次报道从发病山羊中分离到完全不同于BPIV3的山羊副流感病毒3型（CPIV3）。为了明确其对易感动物的致病性，本试验利用CPIV3分离株JS2013采取滴鼻接种的方式清洁级豚鼠，通过RT-PCR、血凝抑制试验、病理解剖学和病理组织学等一系列试验来研究该病原对豚鼠的致病性。

图1 试验豚鼠肺脏、脾脏眼观变化Fig.1 Macroscopic appearance of the lungs and spleen from guinea pigs.

图2 感染组及空白组豚鼠肺脏HE染色图Fig.2 The lung of guinea pigs after(H&E)staining.

试验结果表明，攻毒后2 d感染组的试验豚鼠开始出现打喷嚏、流鼻涕、眼分泌物增多及腹式呼吸的临床症状，并有较高的致死率。攻毒后3 d可以检出病毒血症，持续到攻毒后第7天，攻毒后第3～14天，RT-PCR均可以从肺组织匀浆中检测到排毒。剖检观察感染组试验豚鼠，豚鼠肺出现实变和肿大的症状，病理组织学观察鉴定发现感染组试验豚鼠肺组织出现肺泡间隔增宽、肺泡融合、炎性细胞浸润等变化，但随着感染时间的增长，感染组试验豚鼠的肺部组织逐渐减轻。说明若豚鼠感染前期不死亡的话，则有一定几率可自愈。HI试验表明豚鼠感染此病毒后第3天开始出现血凝抑制抗体，血凝抑制效价为1:23；21 d后血凝抑制抗体仍保持较高的水平，血凝抑制效价1:24；感染组试验豚鼠感染此病毒的第3～21天，血凝抑制效价集中在1:24～1:26。

综上所述，本研究首次证明了CPIV3 JS2013株对豚鼠具有致病性，豚鼠感染后，可产生明显的呼吸道症状，死亡率很高。并导致肺组织出现严重的病理变化，同时产生病毒血症，刺激机体的特异性免疫反应。本研究证明豚鼠可作为山羊副流感病毒3型理想的试验动物感染模型，为今后进一步研究CPIV3感染过程和致病性提供依据。

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Studies on the pathogenesis of Caprine parainfluenza virus type3 JS2013 strain on guinea pigs

Wang Zhongyu,Li Wenliang,Hao Fei,Mao Li,Yang Leilei, Zhang Wenwen,Jiang Jieyuan*
(Institute of Veterinary Medicine,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Jiangsu Nanjing 210014)

For further exploring about the pathogenic of CPIV3 strain JS2013,the guinea pigs as PIV3 susceptible animals were infected with the virus isolate to study on the virus replication and pathological injury in the experimental animal tissues.The noted clinical symptoms were sneezing,eye secretion and dyspnea in the infected guinea pigs at 2 days post-infection(PI). The virus replicated in the blood of the infected animals and could be positively detected from 3 days PI and kept for 7 days PI.Macroscopic appearances of the lungs from infected guinea pigs were almost complete consolidation and swelling.The histopathologic examinations showed that alveoli septa thickening,disappearance of alveolar architecture and inflammatory cell infiltration were seen in the lungs of the diseased.The infected guinea pigs produced the special HI antibodies against CPIV3 in 5 days PI.

CPIV3;Pathogenesis;Guinea pigs

S858.23

1672-9692(2015)09-0001-05

2015-06-27

王钟毓（1990-），女，硕士，研究方向为动物传染病防治。

江杰元（1957-），男，博士，研究员，主要从事动物疫病诊断研究。

江苏省农业科技自主创新资金项目（CX(14)2090）