HPLC法测定小柴胡汤剂中黄琴苷的含量*

兰 雪，唐富山，陈曾妮，张 渊，汪 巍，周旭美

(遵义医学院药学院，贵州遵义 563099)

技术与方法

HPLC法测定小柴胡汤剂中黄琴苷的含量*

兰 雪，唐富山，陈曾妮，张 渊，汪 巍，周旭美

(遵义医学院药学院，贵州遵义 563099)

目的应用高效液相色谱法(HPLC)测定小柴胡汤剂中黄芩昔含量。方法小柴胡汤以水煎法制备，其中黄芩昔的含量用HPLC法进行分析，色谱柱为TSKgel ODSC18(250mm×4.6mm，5μm)，柱温30℃，流动相为甲醇:水:磷酸(体积比为65∶35∶0.7)，流速1 mL/min，检测波长280 nm。结果黄芩昔的线性范围为0.025～1.6 mg/mL，标准曲线为y=18 533x-724.89，R2=0.9993，平均加样回收率为94.58%(RSD=1.76%)，稳定性考察表明小柴胡汤室温放置48 h，其中黄芩昔含量稳定，小柴胡汤中黄芩昔平均含量为3.39 mg/mL(RSD=1.39%)。结论该方法简便易行、灵敏度高、准确可靠，可用于小柴胡汤的质量控制。

小柴胡汤;HPLC;黄答普;含量;质量控制

小柴胡汤为我国汉代名医张仲景《伤寒论》中的经典方剂，由柴胡、黄芩、人参(现多用党参代替)、半夏、甘草、生姜、大枣等7味药材组成，用于治疗伤寒少阳证，具解表散热、疏肝和胃的功效。在现代医学中，小柴胡汤被广泛应用于内科、妇科、儿科、五官科等系统疾病的治疗［1］，尤其在治疗慢性乙型肝炎、肝纤维化，以及预防肝癌中多有应用［2］。由于中药制剂药材来源和提取方式不同等多方面因素，会对其质量产生一定影响，因此对尤其是像小柴胡汤这样应用广泛的中药制剂，进行必要的质量控制是当前中药现代化的重要内容之一。以往文献［3-4］已对采用高效液相色谱法测定小柴胡汤中黄芩昔的含量进行过报道，但从资源节约、实验效率提高的角度考虑，尚有必要进一步优化色谱条件。为了在动物实验研究中控制小柴胡汤制剂质量，并为类似研究提供参考，本实验在前人研究的基础上改进了色谱条件，对测定小柴胡汤中黄芩昔含量所应用的高效液相色谱法进行了优化，以期获得更快速、准确、适用性强的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 安捷伦1260型高效液相色谱仪，进样器(G1329B)，四元泵(G1311C)，二极管阵列检测器(G1315C)，超声仪(昆山市超声仪器有限公司)，天平［梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司］，纯水仪(艾柯实验室超纯水机)。汤剂制备所需药材购自遵义医学院附属医院中药房，经遵义医学院生药教研室杨建文教授鉴定，均为合格药材。黄芩昔(贵州迪大生物科技有限责任公司，GZDD-0037)，甲醇、乙醇、磷酸等分析纯试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，流动相用的甲醇为色谱纯，水为双蒸水。

1.2 色谱条件与溶液配制

1.2.1 色谱条件 十八烷基硅烷键合硅胶为填充的色谱柱TSKgel ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，保护柱(Agilent Zorbax Reliance Cartridge Guard-Columns，4.6 mm×12.5 mm)，甲醇:水:磷酸(65∶35∶0.7)为流动相，流速1 mL/min，进样量5μl，柱温30℃，检测波长280 nm。

1.2.2 小柴胡汤剂的制备 小柴胡汤的药材配伍比例参照2010版《中华人民共和国药典》［5］中小柴胡颗粒的比例，制备方法参照蔡皓等［6］通过正交试验得到的小柴胡汤最佳提取方案，采用水提法。具体步骤为:取柴胡12.5 g、黄芩4.5 g、党参4.5 g、半夏4.5 g、甘草4.5 g、生姜4.5 g、大枣4.5 g，加8倍量的水，煎煮40 min，药液使用纱布过滤，收集滤液，药渣继续加入8倍量的水，煎煮40 min，药液以纱布过滤后，合并前后2次的滤液，浓缩至125 mL即得。

1.2.3 溶液的配制 对照品储备液制备:精密称取黄芩昔对照品16 mg，置10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，摇匀即得。

系列标准溶液的配制:将对照品储备液稀释成系列浓度，分别为1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05和0.025 mg/mL。

小柴胡汤供试品溶液的制备:精密移取1.2.2项制备的小柴胡汤剂10 mL，置25 mL容量瓶中，加入70%乙醇10 mL，超声处理30 min，放冷后加甲醇定容，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，即得。

2 结果

2.1 方法学考察

2.1.1 专属性考察 将黄芩昔对照品用甲醇溶解后进样，如图1所示，黄芩昔对照品的出峰时间为4.87 min;小柴胡汤样品经“1.2.3小柴胡汤供试品溶液的制备”方法处理后进样，如图2所示，小柴胡汤样品中黄芩昔的出峰时间为4.87 min，与黄芩昔对照品出峰时间一致。

图1 黄琴苷对照品色谱图

图2 小柴胡汤样品色谱图

2.1.2 线性考察 按照1.2.3项系列浓度溶液的稀释方法，以浓度为横坐标，以各浓度点的峰面积值为纵坐标，得到线性回归方程y=18 533x-724. 89，R2=0.999 3，结果表明峰面积与黄芩昔浓度在黄芩昔浓度为0.025～1.6 mg/mL时呈现良好的线性相关。

2.1.3 重复性试验 按照药材配伍比例称取各药材，以1.2.2项方法制备成小柴胡汤样品，再按照1.2.3项方法制备小柴胡汤供试品，然后进样，测定峰面积值分别为23 348.3、23 099.7、23 523.8、23 557.0、23 704.8、24 023.5，经计算RSD=1. 33%，小于2%，表明该方法重复性良好。

2.1.4 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，分别于制备后的0、2、4、6、8、24和48 h进行测定，记录峰面积值分别为24 706.0、24 628.2、24 594. 5、24 518.3、24 633.4、24 555.4、24 478.4，计算相对标准偏差，进行稳定性考察，经计算RSD=0. 31%，小于2%，表明室温放置48 h，小柴胡汤中黄芩昔比较稳定。

2.1.5 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液，于1 d内重复进样6次，测定峰面积值分别为24 555.4、24 594.5、24 570.3、24 621.5、24 595.7、24 533.4，计算相对标准偏差，得到RSD=0.129%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 加样回收率考察 取该批小柴胡汤样品9份，每份5mL分别置于25 mL容量瓶中，以每份小柴胡汤样品中黄芩昔含量的低、中、高不同倍量加入黄芩昔对照品溶液，再按照1.2.3项操作处理，每组3份进行测定，记录峰面积值，计算得到的加样回收率为94.58%，经计算相对标准偏差＜2% (见表1)，说明该方法稳定可行。

表1 加样回收率试验结果(n=9)

2.2 小柴胡汤剂中黄答普的含量 取小柴胡汤供试品溶液适量进样后记录峰面积，计算得到该种制备方法得到的小柴胡汤中黄芩昔的平均含量为3. 39 mg/mL(见表2)。

表2 小柴胡汤中黄琴苷的含量测定结果(n=3)

3 讨论

汤剂在现代临床用药过程中仍然被广泛应用，但其质量控制大多是通过对制备过程的经验把握来实施，在提倡中药现代化的形势下，有必要在汤剂的质控中逐步引入现代分析方法。由于水提的方法更接近于汤剂临床用药实际，小柴胡汤中主要的药效成分之一的黄芩昔以水煎煮法为最佳提取方法［7］，因此本试验采用水提法制备小柴胡汤。许多包含有黄芩的中药复方都采用黄芩昔的含量测定进行质控［8］，2010版《中华人民共和国药典》［5］中小柴胡颗粒也以黄芩昔进行质控，因此本文以改进色谱条件的高效液相色谱法测定小柴胡汤剂中黄芩昔的含量。小柴胡汤中黄芩昔的含量测定方法已有报道［9-10］，但各方法都不同程度存在流动相毒性大、成本高和分析时间较长等问题，如纪松岗等［11］用高效液相色谱法测定小柴胡汤中黄芩昔和汉黄芩昔的含量，流动相采用乙睛和水，梯度洗脱，黄芩昔的出峰时间为20 min。本研究采用甲醇和水为流动相，黄芩昔在4.87 min出峰，峰形对称。乙睛是HPLC的流动相的重要选择之一，但色谱纯的乙睛成本较高，而且相对较大的毒性也是乙睛的一个缺点。相比之下，本试验中采用色谱甲醇为主的流动相，整体改善了色谱条件，不仅经济实惠，而且分析时间显著缩短，使得分析方便快捷，并有利于资源的节约与试验效率的提高。

在流动相的调试过程当中，最初参照2010版《中华人民共和国药典》［5］小柴胡颗粒中黄芩昔的含量测定方法中的流动相达不到满意的分离效果，因此本实验在预试甲醇与水的流动相比例时，以药典方法中的色谱条件为基础，当流动相为甲醇-水-磷酸(体积比为47∶53∶0.2)时，存在严重的拖尾现象，继而增大有机相比例来调节，流动相为甲醇-水-磷酸(体积比为80∶20∶0.2)时，峰位前移，而后面的拖尾小峰不仅没有消失而且出现了包峰现象，考虑到黄芩昔属于偏酸性化合物，应适当调节流动相酸度，本文试图通过改变磷酸在流动相中的比例，以改善拖尾现象，为此分别预试了0.2%、0.5%、0.7%的磷酸浓度，发现当磷酸浓度为0. 7%时色谱的拖尾现象明显改善，考虑到酸度不宜过高以保护色谱柱，未进一步提高磷酸浓度，故使用0.7%的磷酸比例。另外在预试时，柱温的变化也可以改变色谱峰的行为，因而，考察了柱温变化对色谱峰的影响，分别预试了25℃、30℃、35℃，结果发现温度升高可以改善拖尾现象，但当35℃时，并没有得到更好的分离效果，故选择30℃作为柱温。流动相中的有机相也不宜过高，因为峰位过于前置，可能会被溶剂峰干扰。当色谱条件以甲醇-水-磷酸(体积比为65∶35∶0.7)为流动相，流速1 mL/min，检测波长280 nm，柱温30℃时，可达到较为满意的分离测定效果。

以中药制剂中1种或数种主要效用单体成分作为质量控制的标准，才能使得中药制剂在临床使用，以及动物实验过程中换算给药剂量时真正做到定量、可控、可重复。尤其是汤剂，在其制备过程中由于药材来源不同、浓缩程度等因素的差异，会造成实际给药剂量的差异，从而影响用药安全或影响试验研究结论的合理获取，因而有必要通过简单易行的质量控制提供给药剂量的参考依据。本文参照2010版《中华人民共和国药典》［5］小柴胡颗粒的质量控制方法，改进了有关色谱条件，应用高效液相色谱法测定小柴胡汤中黄芩昔的含量，方法准确度高、仪器精密度好，具有方便易行、准确可靠、通用性强的特点，可作为临床用药及试验研究中小柴胡汤的质量控制方法，并可为有关制剂的质控和研究提供参考。

［1］胡紫景，郑星宇，薛善乐，等.小柴胡汤的临床应用进展［J］.现代中西医结合杂志，2011，20(2):254-256.

［2］李晋，徐尚福，张晓洁，等.小柴胡汤对肝纤维化大鼠肝脏CYP2E1表达的影响［J］.遵义医学院学报，2014，37(4):393-396.

［3］王永梅，王雪峰，沙明.HPLC法定量分析小柴胡汤中黄芩昔的研究［J］.辽宁中医杂志，2003，30(11): 882-883.

［4］石莹.HPLC测定小柴胡汤丸中黄芩昔的含量［J］.中成药，2007，29(7):23-25.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:510.

［6］蔡皓，庄延双，刘晓，等.正交优选小柴胡汤的提取工艺［J］.中药材，2012，35(12):2036-2039.

［7］刘龙忠.炮制对常用昔类中药性能的影响［J］.遵义医学院学报，2005，28(5):476-477.

［8］李凤，王文全，游佩进，等.黄芩中黄酮类成分提取工艺研究进展［J］.中国现代中药，2010，12(7):5-8.

［9］牛获山，吴悦涛.HPLC检测小柴胡汤剂型改良后黄芩昔含量［J］.黑龙江医药，2008，21(2):6-7.

［10］温勇，王德杭，陈瑞云.小柴胡汤的质量标准研究［J］.中药新药与临床药理，2009，20(6):562-566.

［11］纪松岗，刘晓帆，朱臻宇.高效液相色谱法检测小柴胡汤中黄芩昔、汉黄芩昔的含量［J］.第二军医大学学报，2010，31(9):1010-1013.

［收稿2015-05-14;修回2015-06-20］

(编辑:王福军)

Determ ination of baicalin in Xiaochaihu decoction by HPLC

Lan Xue，Tang Fushan，Chen Zengni，Zhang Yuan，Wang Wei，Zhou Xumei
(School of Pharmacy，Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China)

Objective To establish the HPLC method for determination of baicalin in Xiaochaihu decoction. M ethods Xiaochaihu decoction was prepared through extractingmethod of decoction with the prescription according to Xiaochaihu granules in the Chinese Pharmacopoeia(2010 edition)and then baicalin in the Xiaochaihu decoction was determined through column of TSKgel ODSC18(250 mm×4.6 mm，5μm)with column temperature of 30℃，mobile phase ofmethyl alcohol-water phosphoric acid(65:35:0.7)with a flow rate of 1.0 ml/min and at detection wavelength of280 nm.Results A good linearity can be seen from the calibration curve of baicalin in the range of 0.025 mg/ml to 1.6 mg/mlwith R2of0.999 3 and the average recovery was94.58%with RSD of 1.76%.Xiaochaihu decoction was stable in 48 hours after preparation.The average content of baicalin in Xiaochaihu decoction was 3.39 mg/ml(RSD=1.39%).Conclusion HPLC method might be ideally used to the quality control of Xiaochaihu decoction for convenient，highly sensitive，accurate and reliable characteresitic.

Xiaochaihu decoction;HPLC;baicalin;content;quality control

R927.2

A

1000-2715(2015)04-0435-04

贵州省科学技术基金资助项目(NO:黔科合J字［2013］2323)。

唐富山，男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向:临床药学，E-mail:fstang@zmc.edu.cn;周旭美，女，教授，硕士生导师，研究方向:临床药学，E-mail:546265853@qq.com。