一株产细菌素乳杆菌的鉴定及其 细菌素编码基因的获得

吴 轶，贡汉生*，刘文丽，李明月，王华东，王俊娟

一株产细菌素乳杆菌的鉴定及其 细菌素编码基因的获得

吴 轶，贡汉生*，刘文丽，李明月，王华东，王俊娟

（鲁东大学食品工程学院，山东 烟台 264025）

应用双层平板打孔法，从自制樱桃酒里分离的乳杆菌中筛选到一株对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有明显抑制作用的菌株，命名为LD 1.0008。通过API 50 CHL糖发酵产酸实验、16S rDNA基因序列分析及其特异性recA基因多重聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR），鉴定LD 1.0008为植物乳杆菌。排除有机酸的干扰，用多种蛋白酶处理后，其抑菌活性均有明显降低，而用过氧化氢酶处理后其抑菌活性基本不变，从而确定LD 1.0008所产生的抑菌物质为细菌素。使用已报道的10 对植物乳杆菌细菌素基因片段设计的引物对菌株LD 1.0008进行PCR扩增，发现其至少含有4 个植物乳杆菌素相关编码基因，即plnD、plnO、plnV和plnW。

细菌素；乳杆菌；鉴定；细菌素编码基因

细菌素是细菌在代谢过程中合成并分泌到环境中的一类对同种或亲缘关系较近的微生物有杀灭或抑制作用的蛋白质或多肽物质[1]。细菌素的抑菌作用具有广谱性、稳定性和无毒性等特点，且加入食品后不影响食品的感官性状。目前已成功应用于乳制品、肉制品、罐装蔬菜、果汁、酒精饮料及葡萄酒的酿造等[2-5]。Nisin早在1998年已被50多个国家和地区允 许作为食品防腐剂，并在乳制品和罐头制品中广泛使用[6]。

植物源乳酸菌的研究正日益得到重视。来源于植物的植物乳杆菌可产生多种植物乳杆菌素，抑制其他微生物的生长，多数植物乳杆菌素属于Ⅰ类或Ⅱ类细菌素，具有分子质量较小、热稳定性高、可被蛋白酶降解的特点，主要抑制乳酸菌和其他革兰氏阳性细菌，此外，据报道BacTN365等还能抑制革兰阴性菌和霉菌的生长[7-8]。同时植物乳杆菌素的作用方式一般为杀菌和溶菌[9]，由于其自身的特性以及伴随菌株在发酵过程中所产生的保健功效，使植物乳杆菌素具有广泛的应用前景。产植物乳杆菌素的菌株主要从乳制品、植物原材料或发酵食品中

1.1 菌种、培养基与试剂

从自制樱桃酒中分离出的34 株乳杆菌中筛选出1 株具有明显抑菌活性的菌株，暂命名为LD 1.0008。指示菌株：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923、大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 25922。

乳杆菌培养选用改良MRS培养基 英国Oxoid公司；指示菌培养选用营养肉汤培养基 北京奥博星公司。

过氧化氢酶、胃蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶美国Sigma公司；蛋白酶K 美国Amresco公司；木瓜蛋白酶 德国AB Enzymes公司；PCR Master Mix 立陶宛Thermo Scientifi c公司。

1.2 仪器与设备

SPX智能型生化培养箱 宁波江南仪器厂；高速冷冻离心机 上海安亭科技仪器厂；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增仪 杭州博日科技有限公司；DYY-10C型电泳仪 北京市六一仪器厂；SC850型凝胶成像系统 上海山富科学仪器有限公司；细菌基因组提取试剂盒 天根生化科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 无细胞发酵上清液的制备

参考贡汉生等[11]的方法制备细菌素的无细胞发酵上清液，将菌株在30 ℃条件下静置培养到稳定期（OD600nm≥1.9），12 000×g、4 ℃离心15 min收集上清液，用3 mol/L NaOH溶液调节pH值至6.5，排除有机酸的干扰。上清液用0.22 μm滤膜过滤后冷冻干燥浓缩，冻干后加入原体积1/10的灭菌超纯水，溶解后放入-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3.2 具有抑菌活性菌株的筛选

采用双层平板打孔法[12]筛选具有抑菌活性的菌株，指示菌选用金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌。

1.3.3 菌株产抑菌物质的初步鉴定

取等量无细胞发酵上清液（pH 6.5），使用3 mol/L HCl溶液和3 mol/L NaOH溶液分别调pH值至以下各酶最适pH值，将终浓度1 mol/mL的过氧化氢酶、胃蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶分别加入无细胞发酵上清液中，37 ℃条件下培育2 h。将pH值调回到6.5，按1.3.2节方法进行抑菌实验，用冻干浓缩相同倍数的改良MRS培养基与无细胞发酵上清液做相同处理后作为对照。筛选得到[7,10]，本实验旨在从自制樱桃酒中分离出具有高抑菌活性细菌素的乳杆菌，对产生细菌素的乳杆菌进行鉴定并获得其所产细菌素的编码基因，为植物乳杆菌素应用于食品防腐保鲜提供实验基础。

1 材料与方法

1.3.4 糖发酵产酸实验

挑取活化好的菌株4 500×g离心10 min，用2 mL无菌生理盐水重悬菌体制成细胞悬液。根据API 50 CHL系统说明书操作。将结果输入系统测定软件API plus中，通过归纳菌株可发酵糖的种类初步确定其归属的种类。

1.3.5 16S rDNA基因和recA基因的PCR扩增及测序

依据试剂盒说明书方法提取菌株LD 1.0008基因组DNA。使用乳杆菌16S rDNA基因通用引物[13]和recA基因的特异性引物[14]扩增，引物序列如表1所示。16S rDNA基因和recA基因的PCR反应体系均为50 μL。16S rDNA扩增的循环参数为：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s、55 ℃复性45 s、72 ℃延伸90 s，35 个循环；72 ℃保温10 min。recA基因扩增的循环参数为：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s、55 ℃复性45 s、72 ℃延伸40 s，35 个循环；72 ℃保温10 min。反应完毕后分别取5 μL用于1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下分析结果。PCR产物送交上海生工生物工程技术服务有限公司进行纯化后测序。得到的PCR产物序列通过BLAST在GenBank中进行同源性比较，并将其鉴定到种。

表1 16S rDNA基因和rreeccAA基因的PCR扩增引物和条件Table 1 PCR primers used for 16S rDNA sequence analysis andrrecAbsd PCR

1.3.6 植物乳杆菌所产细菌素编码基因的获得

表2 植物乳杆菌素的PCR扩增引物和条件Table 2 PCR primers and thermal cycling conditions for the detection of plantariicciinn

如表2所示，根据已报道的植物乳杆菌素相关基因选择10 对引物，PCR扩增菌株LD 1.0008中可能含有的植物乳杆菌素相关基因，并进行1%琼脂糖凝胶电泳。

2 结果与分析

2.1 菌株筛选结果及其菌落特征

从自制樱桃酒中分离出的34 株乳杆菌，以金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌为指示菌进行抑菌实验，以抑菌圈直径＞10 mm记为具有抑菌活性，从34 株乳杆菌中筛选出一株对两种指示菌均有明显抑菌活性的菌株，命名为LD 1.0008。

菌株LD 1.0008的菌落特征：在改良MRS培养基上培养36 h后菌落直径大小为1.5 mm左右，光滑、湿润、圆形、突起、呈乳白色、不透明、边缘整齐。

菌株LD 1.0008的菌体特征：短杆、呈单个均匀散落、革兰氏阳性、着色均匀。

2.2抑菌物质初步鉴定结果

将无细胞发酵上清液调pH值至6.5，排除了有机酸的干扰，经各种酶处理后发酵上清液的抑菌效果如表3所示。经过氧化氢酶处理后，发酵上清液的抑菌效果与未经处理的对照组相差不大，可排除过氧化氢的干扰；而经胃蛋白酶、α-糜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶处理后，无细胞发酵上清液的抑 菌圈显著减小，从而确定该菌株产生的抑菌物质为蛋白质类细菌素。

表3 酶处理后的抑菌效果Table 3 Antibacterial activity after enzymatic treatments

2.3糖发酵产酸实验结果

按照API 50 CH试剂条使用说明，采用API 50 CHL培养基对菌株LD 1.0008进行49 种碳水化合物的发酵产酸实验，结果见表4。将表4中的鉴定结果用API plus软件进行鉴定，结果表明，菌株LD 1.0008与植物乳杆菌有66%的同源性，与戊糖乳杆菌有34%的同源性。

表4 LD 1.0008的API 50 CHL反应结果Table 4 Carbohydrate utilization of LD 1.0008 using API 50 CHL

2.4 16S rDNA基因与recA基因的鉴定结果

通过对菌株LD 1.0008的16S rDNA基因和recA基因进行PCR扩增，分别获得了大小为1 479 bp和287 bp的基因片段，如图1所示，将所得序列在BLAST软件上与已知菌株的16S rDNA序列和recA序列进行同源性对比，结果表明菌株LD 1.0008的16S rDNA序列与GenBank中植物乳杆菌、戊糖乳杆菌和亚利桑那乳杆菌的16S rDNA序列同源性均达到99%以上。

图1 16S rDNAA与rreeccAA基因PCR扩增产物电泳图Fig.1 PCR amplification of 16S rDNA andrecAgenes

LD 1.0008的recA基因序列与植物乳杆菌的recA基因序列有99%的同源性，与亚利桑那乳杆菌的recA基因序列有94%的同源性，与戊糖乳杆菌的部分recA基因序列有88%的同源性，据此判定菌株LD 1.0008为植物乳杆菌。

2.5产植物乳杆菌素编码基因的获得

使用10 对已报道的乳杆菌素引物分别对菌株LD 1.0008基因组DNA进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测后发现，应用plnD、plnO、plnV和plnW的引物扩增出现了基因条带，PCR产物纯化后测序，分 别得到382、189、710、728 bp的基因片段，在GenBank中进行基因序列比对，4 条基因序列与plnD、plnO、plnV和plnW部分基因序列的同源性都达到99%以上，据此可推断植物乳杆菌LD 1.0008可产生多种植物乳杆菌素。

图2 乳杆菌素编码基因PCR扩增产物电泳图Fig.2 PCR amplification of plantaricin genes

3 结 论

本实验筛选得到一株对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌均有抑制作用的乳杆菌LD 1.0008。通过API 50 CHL生化鉴定、16S rDNA基因序列分析及其特异性recA基因多重PCR反应，最终鉴定该菌为植物乳杆菌。使用已报道的10 对根据植物乳杆菌素基因片段设计的引物，对菌株LD 1.0008进行PCR扩增，发现其至少含有4 个植物乳杆菌素相关编码基因：plnD、plnO、plnV和plnW。与目前国内外已发现的高产细菌素的植物乳杆菌相比，LD 1.0008产生的细菌素种类多，可同时抑制革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌，且可被多种蛋白酶水解，不会对人体造成伤害，这对于分离LD 1.0008产生的植物乳杆菌素并将其应用于食品防腐保鲜具有重要意义。

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Identification of a Bacteriocin-Producing Lactobacillus and Acquisition of Bacteriocin-Encoding Genes

WU Yi, GONG Hansheng*, LIU Wenli, LI Mingyue, WANG Huadong, WANG Junjuan
(College of Food Engineering, Ludong University, Yantai 264025, China)

OneLactobacillusstrain isolated from homemade cherry wine revealed significant inhibitory activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria using double plate punching method, which was named LD 1.0008. LD 1.0008 was identified asLactobacillus plantarumby its carbohydrate fermentation pattern using API 50 CHL test kits, 16S rDNA sequence analysis andrecA-based polymerase chain reaction (PCR) test. The antibacterial activity was significantly decreased after protease treatment, whereas it remained stable after treatment with catalase. The antibacterial substances were confirmed as bacteriocin after excluding the interference of organic acid. PCR amplification was carried out using previously reported 10-pair plantaricin primers. It was indicated that at least 4 bacteriocin-encoding genes could be produced by LD 1.0008, includingplnD,plnO,plnVandplnW. It is of great significance for the separation and application of plantaricins of LD 1.0008.

bacteriocin; Lactobacillus; identifi cation; bacteriocin-encoding genes

TS201.3

A

10.7506/spkx1002-6630-201511021

2014-07-01

国家自然科学基金青年科学基金项目（31301565）；山东省自然科学基金青年基金项目（ZR2012CQ009）；烟台市科技计划项目（2012125）；鲁东大学科研基金项目（LY2010016）

吴轶（1993—），男，本科生，研究方向为食品微生物。E-mail：mbb_wuyi@163.com

*通信作者：贡汉生（1981—），男，副教授，博士，研究方向为食品微生物。E-mail：hsgong_221@163.com