染色体9p21单核苷酸多态性与脑梗死的相关性分析

朱 扬，卢钟娇，傅 毅

(1.上海市第二人民医院神经内科，上海200011;2.上海交通大学附属瑞金医院神经内科，上海200025)

随着社会老年化的发展，无论在城市或农村，因脑血管疾病入院的患者人数已领先于多种传统高发病，在全死因顺位中呈现出明显前移的趋势，特别在女性患者中其死亡率甚至超过恶性肿瘤和心脏病，居于首位。然而，脑梗死的发病机制至今仍不明确，可能是受遗传、环境和血管危险因素共同作用的多因子复杂疾病[1]。已有孪生子和家系的研究表明，基因变异可通过影响常见危险因素或通过调整危险因素对终末靶器官的作用而直接影响脑卒中的风险、梗死面积及预后[2]。因此，对于脑梗死可控制因素的预防是非常有必要的。

全基因组关联分析研究(genome wide association study，GWAS)发现，人类染色体 9p21.3上参与细胞增殖调控的遗传学区带与心血管疾病的致病显著相关，尤其是在白种人群，纯合子变异能增加冠脉疾病(coronary artery disease，CAD)的发病率约40%[3-5]。而后续研究表明，该染色体上相同片段同样也是脑梗死尤其是大动脉硬化型脑梗死的易感区，这种遗传重叠性最可能归因于其共同的动脉粥样硬化发病机制，并与已知的经典致病通路有所不同，然而针对中国人群的研究甚少[6-7]。

随着遗传学研究手段的日趋完善，我们采用聚合酶链反应—高温连接酶检测反应(polymerase chain reaction-ligase detection reaction，PCRLDR)[10]、选择经GWAS及Meta分析已证实的染色体9p21.3上的rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574 和 rs2383207 6个动脉粥样硬化相关疾病的易感位点[8-13]，探讨其与非心源性脑梗死发病风险的相关性，论证其在中国汉族人群中是否可作为上述血管硬化性疾病的共同发病基础。

材料和方法

一、研究对象

选取2009年8月至2013年12月在上海交通大学医学院附属瑞金医院、上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院、上海市第二人民医院、闵行区中心医院和公利医院神经内科住院就诊的急性脑梗死患者528例，包括无颈动脉斑块的患者153例，男96例，女57例，年龄为(56.56 ±7.65)岁;合并颈动脉斑块的患者375例，男256例，女119 例，年龄(60.90 ±6.24)岁。

所有入选脑梗死患者的诊断标准参考2010年颁布的中国急性缺血性脑卒中诊治指南[14]，经TOAST(Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment)分型[15]纳入大动脉硬化型脑梗死和腔隙性脑梗死2种亚型。入选标准为:(1)急性起病;(2)局灶性神经功能缺损，少数为全面神经功能缺损;(3)症状和体征持续数小时以上，且3 d以内;(4)脑磁共振显示有责任病灶。排除标准为:(1)心源性脑梗死;(2)脑CT或磁共振可见脑出血、占位病变、感染等颅内病变;(3)冠心病、周围血管疾病、恶性肿瘤、严重肝肾功能减退和甲状腺功能异常等代谢性疾病;(4)有脑梗死家族遗传史;(5)年龄超过70岁。用颈部血管多普勒超声检测颈动脉斑块形成情况[斑块形成为颈动脉内膜中层厚度(carotid intima-media thickness，IMT)≥1.5 mm 或有赘生物形成][16]。

258名正常对照者是同期来自各医院的健康体检者，其中男127名，女131名，年龄(56.34±7.85)岁，头颅磁共振显示无明显异常并无颈动脉斑块存在。

根据既往研究发现遗传因素对70岁以下人群的影响更为显著，因此我们将脑梗死组的年龄设定在70岁以下[17-18]。同时为了降低部分不可控制因素的影响，具体分析在不同年龄段人群中遗传因素对疾病的作用差异，我们按照世界卫生组织(World Health Organization，WHO)的划分标准将入选对象归类为青年人(＜45岁)、中年人(45～65岁)及老年人(＞65岁)3个年龄段。上述对象均为中国上海地区居住的汉族人，彼此无血缘关系;病前至少1个月未使用影响纤维蛋白溶解和凝血的药物。

二、方法

所有被检者禁食12 h，晨起空腹抽取静脉血5 mL，在乙二胺四乙酸抗凝管中混匀，其中2 mL用作DNA提取;另3 mL静脉血分离作血清血糖、甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)测定，并记录血压和相关临床资料。

采用酚氯仿法提取全血基因组DNA，通过引物设计软件Primer Express、Oligo进行引物设计，见表1，再经PCR-LDR检测并进行基因分型。

多重PCR扩增:PCR反应总体积为20μL，包括 2μL 1× buffer，3 mmol/L Mg2+0.6μL，2 mmol/L dNTP，上、下游引物(50 ng/L)各 2μL，DNA模板50 ng，Taq DNA聚合酶1 U。扩增步骤:95℃预变性120 s，然后按94℃ 30 s、50℃90 s、65℃ 60 s共35循环，最后65℃延长至10 min;循环结束后，取2μL反应产物在3.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

多重LDR反应:LDR反应总体积为10μL，包含1μL 1×buffer、probe 各 2 pmol/μL、PCR 产物4μL、NEB Taq DNA连接酶2 U。反应循环参数:95℃ 预变性120 s，然后按94℃ 15 s、50℃25 s共40循环。后各取1μL LDR连接产物与1μL ABI GS-500 ROX荧光标记相对分子质量标准和1μL去离子甲酰胺上样液混合，95℃加热变性2 min，置于冰水混合物上急速冷却。

表1 6个位点的基因库号、引物序列和PCR产物长度

LDR产物测序电泳并分析:使用PRISM 3730型DNA测序仪，于5%聚丙烯酰胺和5 mol/L尿素中进行 3 000 V毛细管电泳 2.5 h;采用GENESCANTM672软件、Genemapper软件进行数据收集并进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)位点的基因分型。

PCR产物核苷酸序列测定:随机选取上述染色体9p21.3片段6个位点的野生型、纯合和杂合变异型PCR产物各2例，由上海翼和应用生物技术有限公司直接测序验证。

三、统计学方法

统计数据用SPSS 18.0统计软件进行统计，先行单因素分析筛查可能的危险因素变量再引入多因素分析。计量资料的比较采用正态分布性检验及方差齐性检验，对于正态分布资料，使用t检验;对于偏态分布资料，使用Mann-Whitney U法检验。计数资料采用χ2检验，计算等位基因和基因型频率。再通过多元Logistic回归模型分析校正年龄、性别、高血压等暴露因素后的比值比(odds ratio，OR)及 95%置信区间(confidence interval，CI)，对有统计学差异的位点探讨基因交互作用。统计效能，α双侧=0.05。同时用SHEsis软件行配对连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)检验计算 D'(Lewomin系数)，当 D'＞0.7时认为存在强的连锁不平衡[19]。

结 果

一、染色体9p21.3片段6个位点的基因测序

染色体9p21.3片段6个位点的rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574 和rs2383207野生型、纯合型和杂合变异型的基因测序图见图1～6。

图1 rs10757278位点基因测序图

图2 rs1333049位点基因测序图

图3 rs2383206位点基因测序图

图4 rs1537378位点基因测序图

图5 rs4977574位点基因测序图

图6 rs2383207基因测序图

二、背景特征

无颈动脉斑块的脑梗死患者相比正常对照人群的高血压患病率、血压(收缩压、舒张压)参数明显升高(P＜0.05)，而平均年龄构成、血脂、血糖水平未发现明显差异(P＞0.05)。同时对所有脑梗死患者的资料分析发现，有颈动脉斑块者的高血压、糖尿病患病率较无斑块者增加(P＜0.05)，特别是年龄、收缩压和HDL-C的平均水平在二组间差异均有统计学意义(P＜0.05)。建立多元逐步回归模型后也发现男性和舒张压升高的个体更易发生脑梗死(P＜0.05)，高龄和HDL-C水平下降与颈动脉斑块的发生明显相关(P＜0.05)。见表2。

表2 脑梗死患者和正常对照者的一般资料

三、无颈动脉斑块的脑梗死组和正常对照组之间9p21 6个位点基因分型分布

Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验结果显示，本研究群体在各基因位点上的分布频率均符合遗传平衡，具有群体代表性，且经LDR均检测出野生型、纯合和杂合变异型3种基因型。无论是在＜45岁还是超过65岁2个年龄段，相对于正常对照组，9p21区带上rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574 和 rs2383207 的等位基因频率分布在无颈动脉斑块的脑梗死组中差异无统计学意义(P＞0.05);而在中年人群中，无颈动脉斑块的脑梗死组rs2383206和rs4977574的G等位基因携带人数显著增加(分别为55.0%和 54.2%)，明显多于正常对照组(分别为 45.9% 和 44.4%，P=0.024、0.015)，但在其余4个位点却未发现有意义的结论。并且经多元Logistic回归模型计算，在校正年龄、性别及高血压等传统危险因素后，仍然可在rs2383206和rs4977574 2个位点得到同 样 的结 果 (P=0.021、0.013)。其 中，rs2383206、rs4977574的G等位基因携带者的脑梗死易感性比A等位基因携带者分别高出0.472 和0.519 倍(OR=1.472，95%CI为1.060 ～2.044;OR=1.519，95%CI为1.094 ～2.110)，见表3。同时对基因型研究后发现，脑梗死组中rs2383206、rs4977574的 GG基因型的分布频率(分别为31.1%和29.4%)均高于正常对照组(分别为20.5%和19.0%)，也以中年人群的差异为主(P=0.059、0.038)。

表3 无颈动脉斑块的脑梗死组和正常对照组之间的等位基因频率分布 [例(%)]

四、中年人群2个位点联合分析和6个位点的连锁分析

对于多因子复杂疾病，单个基因位点的作用可能仅仅是微效性的表现，故多基因的联合和连锁分析是必不可少的研究手段[20]。为此，我们进一步分析了在中年人群有统计学差异的rs2383206和rs4977574 2个位点的基因联合作用。同时携带GG纯合子的个体在无颈动脉斑块的脑梗死组有26.1%，而正常对照组只有17.8%(P=0.030)，提示2个位点同时携带非GG纯合突变基因型(GA+AA)的个体发生脑梗死的风险低于同时含有GG纯合突变基因型的个体，可能是其易感性的0.577倍，而其中只有一个位点携带A等位基因(GA+AA)的个体，在群体中的分布仅为个位数，未发现在两组之间的统计学差异(P＞0.05)。见表4。另外经过 SHEsis软件分析，选取的9p21区带上的6个位点之间存在强连锁不平衡关系(D'=0.85 ～0.99)。见图1。

表4 45～65岁人群校正后的rs2383206和rs4977574 2个位点联合分析

图7 9p21区带上的6个位点的连锁不平衡

讨 论

本研究检测了染色体9p21区带上既往已被报道的与CAD/心肌梗死发病易感相关、距离约64 kb的 6个位点的 SNP。我们发现，SNP rs2383206、rs4977574的G等位基因在中年人群中表现出脑梗死的易感性，而其余4个位点的SNP与脑梗死的相关性在中国汉族人群中并不明确。

rs10757278、rs1333049、rs2383206、rs1537378、rs4977574和rs2383207这6个位点集中在9号染色体长臂21.3区域一段长约100 kb的 DNA序列内，与2个已知的抑癌基因——细胞周期依赖性蛋白激酶抑制因子2A(cyclin-dependent kinase inhibitors 2A，CDKN2A)和 CDKN2B处于同一连锁不平衡结构域中。CDKN2A和CDKN2B分别编码CDK4(INK4)家族中的p16INK4a和p15INK4b及一个与家族抑制子完全无关的蛋白p14ARF，对调节细胞增殖、衰老及凋亡都起着重要作用，并能诱导转化生长因子而影响动脉粥样硬化的发生，可能与既往造成动脉粥样硬化的传统危险因素的发生机制有所不同[21-22]。同时，如果靶向敲除小鼠4号染色体上70 kb的9p21.3区域同源重复序列基因，发现突变小鼠中CDKN2A和CDKN2B的表达明显减少，主动脉平滑肌的增殖能力增加了一倍，这与动脉粥样硬化的发生息息相关[23]。

在本研究中，我们前期筛选了大约800例的急性脑梗死患者，前瞻性地剔除了颈动脉斑块这一危险因素对于脑梗死发生可能的影响，仅将无颈动脉斑块的急性脑梗死患者作为病例组纳入分析，并通过多元Logistic回归校正相关危险因素，加入SNP性联合分析。从而得出，在研究对象人数分布最多的45～65岁这个年龄段，染色体9p21的SNP(rs2383206、rs4977574)与急性脑梗死的易感性相关。同时发现，我们选取的9p21区带上的6个位点之间存在较强的连锁不平衡关系，其中有临床意义的2个位点突变型在对脑梗死的发病上表现出协同效应，有可能对相关疾病的发生有叠加作用，更加容易发生脑梗死，进而提示通过遗传学手段实现对脑梗死早期干预的重要性，特别是在社会的主力军——中年群体尤为重要。此外，我们入组的急性脑梗死患者都排除了心源性脑梗死亚型，降低了心源性因素对本研究的影响，进一步说明了9p21相关位点的SNP对于脑梗死的发生有其独特的作用机制，这也间接解释了我们的结果可能与其他研究的不一致。

近来HU等[23]对中国北方人群的研究发现，SNP rs2383206 GG/GA携带者发生大动脉硬化型脑梗死的风险较AA纯合子明显增加(P=0.002);同时瑞士学者根据(Coronary Artery Disease Genome-Wide Replication and Meta-Analysis Study，CARDIoGRAM)研究总结的25个CAD关联SNP，对3 986例脑梗死患者和2 459名健康对照者进行基因分型，特征性的发现染色体9p21.3上的SNP rs4977574与脑梗死的易感性相关(OR=1.12，95%CI:1.04 ～ 1.20，P=0.002)，尤其是在大动脉硬化型脑梗死亚型中表现明显(OR=1.36，95%CI:1.13 ～1.64，P=0.001)，这也进一步提示了该位点可能是急性脑梗死易患因素的潜在意义[11]，均与我们的研究结果相似。从中可以看出，染色体9p21 rs2383206、rs4977574 2个位点的遗传变异同样可能是中国汉族人群发生急性脑梗死的风险因素。

总之，染色体9p21 rs2383206、rs4977574 2个位点的SNP与急性脑梗死的发生易感性有一定关联。为了进一步明确该区带与脑梗死的遗传易感性及发病关联，需要大样本、多中心、多种族的研究证实。同时，后期研究应注意细化卒中分型，统一相关入组标准，对各年龄段针对性的研究，降低样本的选择偏倚，并且重视遗传与环境因素的交互作用，还可通过相关细胞和动物模型进行验证。综上所述，我们的研究结果可能为急性脑梗死的早期预防、个体化治疗和相关遗传学的机制研究奠定一定的基础。

[1]DELLA-Morte D，GUADAGNI F，PALMIROTTA R，et al.Genetics of ischemic stroke，stroke-related risk factors，stroke precursors and treatments[J].Pharmacogenomics，2012，13(5):595-613.

[2]FLOSSMANN E，SCHULZ UG，ROTHWELL PM.Systematic review of methods and results of studies of the genetic epidemiology of ischemic stroke[J].Stroke，2004，35(1):212-227.

[3]MCPHERSON R，PERTSEMLIDIS A，KAVASLAR N，etal. A commonalleleonchromosome 9 associated with coronary heart disease[J].Science，2007，316(5830):1488-1491.

[4]SAMANI NJ，ERDMANN J，HALL AS，et al.Genomewide association analysis of coronary artery disease[J].N Engl J Med，2007，357(5):443-453.

[5]SCHEFFOLD T，KULLMANN S，HUGE A，et al.Six sequence variants on chromosome 9p21.3 are associated with a positive family history of myocardial infarction:a multicenter registry[J].BMC Cardiovasc Disord，2011，11(7):9.

[6]ANDERSON CD，BIFFIA，ROSTNS，etal.Chromosome 9p21 in ischemic stroke:population structure and meta-analysis[J].Stroke，2010，41(6):1123-1131.

[7]GSCHWENDTNER A，BEVAN S，COLE JW，et al.Sequence variants on chromosome 9p21.3 confer risk for atherosclerotic stroke[J].Ann Neurol，2009，65(5):531-539.

[8]ZHANG Z，WANG BJ，GUAN HY，et al.A LDRPCR approach for multiplex polymorphisms genotyping of severely degraded DNA with fragment sizes＜100 bp[J].J Forensic Sci，2009，54(6):1304-1309.

[9]HECKMAN MG，SOTO-ORTOLAZA AI，DIEHL NN，et al.Genetic variants associated with myocardial infarction in the PSMA6 gene and Chr9p21 are also associated with ischaemic stroke[J].Eur J Neurol，2013，20(2):300-308.

[10]LÖVKVIST H，SJÖGREN M，HÖGLUND P，et al.Are 25 SNPs from the CARDIoGRAM study associated with ischaemic stroke[J].Eur J Neurol，2013，20(9):1284-1291.

[11]TRAYLOR M，FARRALL M，HOLLIDAY EG，et al.Genetic risk factors for ischaemic stroke and its subtypes(the METASTROKE Collaboration):a metaanalysis of genome-wide association studies[J].Lancet Neurol，2012，11(11):951-962.

[12]SMITH JG，MELANDER O，LÖVKVIST H，et al.Common genetic variants on chromosome 9p21 confers risk of ischemic stroke:a large-scale genetic association study[J].Circ Cardiovasc Genet，2009，2(2):159-164.

[13]The group of guidelines for acute ischemic stroke in Chinese Medical Association.Guidelines for acute ischemic stroke in China of 2010[J].China Medical News，2010，25(14):16-19.

[14]ADAMS HP，BENDIXEN BH，KAPPELLE LJ，et al.Classification of subtype of acute ischemic stroke.Definitions for use in a multicenter clinical trial.TOAST.Trial of Org 10172 in acute stroke treatment[J].Stroke，1993，24(1):35-41.

[15]STEIN JH，KORCARZ CE，HURST RT，et al.Use of carotid ultrasound to identify subclinicalvascular disease and evaluate cardiovascular disease risk:a consensus statement from the American Society of Echocardiography Carotid Intima-Media Thickness Task Force.Endorsed by the Society for Vascular Medicine[J].J Am Soc Echocardiogr，2008，21(2):93-111.

[16]SCHULZ UG，FLOSSMANN E，ROTHWELL PM.Heritability of ischemic stroke in relation to age，vascular risk factors，and subtypes of incident stroke in population-based studies[J].Stroke，2004，35(4):819-824.

[17]OLSSON S，JOOD K，BLOMSTRAND C，et al.Genetic variation on chromosome 9p21 shows association with the ischaemic stroke subtype largevessel disease in a Swedish sample aged≤70[J].Eur J Neurol，2011，18(2):365-367.

[18]SHI YY，HE L. SHESIS，a powerful software platform for analyses of linkage disequilibrium，haplotype construction，and genetic association at polymorphism loci[J].Cell Res，2005，15(2):97-98.

[19]KRUGLYAK L.Prospects for whole-genome linkage disequilibrium mapping of common disease genes[J].Nat genet，1999，22(2):139-144.

[20]JARINOVA O，STEWART AF，ROBERTS R，et al.Functional analysis of the chromosome 9p21.3 coronary artery disease risk locus[J].Arterioscler Tromb Vasc Bio，2009，29(10):1671-1677.

[21]BURD CE，JECK WR，LIU Y，et al.Expression of linear and novel circular forms of an INK4/ARF-associated non-coding RNA correlates with atherosclerosis risk[J].PLoS Genet，2010，6(12):e1001233.

[22]VISEL A，ZHU Y，MAY D，et al.Targeted deletion of the 9p21 non-coding coronary artery disease risk interval in mice[J].Nature，2010，464(7287):409-412.

[23]HU WL，LI SJ，LIU DT，et al.Genetic variants on chromosome 9p21 and ischemic stroke in Chinese[J].Brain Res Bull，2009，79(6):431-435.