流式细胞术检测外周血白血病细胞在AL复发的临床价值研究

方健源，谢碧霞，罗 韬，胡淑芬，谭冬梅

(1.广州市番禺区中心医院检验科，广东广州511400;2.广州市番禺区中心医院血液科，广东广州511400)

随着白血病治疗方案的改进，白血病治疗水平不断提高，急性白血病(acute leukemia，AL)有了较高的缓解率，但仍有相当一部分患者复发。目前认为造成白血病复发的关键因素是白血病经治疗后体内仍残留少量的肿瘤细胞，即存在微小残留病变(minimal residual disease，MRD)，这些肿瘤细胞的克隆增殖导致白血病复发。白血病细胞通常表达异常的表面抗原表型，即白血病相关表型[1]，具有异常光散射特性，因此能与正常造血成分相互区别。联合利用多种单克隆抗体，多参数流式细胞术(flow cytometry，FCM)可以同时检测细胞表面不同抗原表达的多参数荧光信号，进而识别完全缓解后混于正常造血细胞中的MRD。本研究收集AL患者的骨髓和外周血标本进行检测分析，探讨FCM检测外周血白血病细胞在AL复发的临床价值。

材料和方法

一、研究对象

选择2012年1月至2013年12月广州市番禺区中心医院血液科收治的71例AL患者(不包括急性早幼粒细胞白血病患者)，其中急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)44例、急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)27例，于达完全缓解时及巩固化疗期间监测。诊断符合FAB及2008年世界卫生组织的诊断标准[2]。

二、方法

1.多参数FCM 采集外周血乙二胺四乙酸二钾抗凝，利用四色荧光(4种荧光素分别为异硫氰酸荧光素、藻红蛋白、别藻青蛋白、多甲藻叶绿素蛋白)直接免疫标记法进行免疫分型检测。在每支检测试管中加1×106有核细胞。根据每例患者的白血病特点选择单克隆抗体组合(试剂均为美国BD公司产品)，按照试剂说明书进行操作。至少收集10万个可供分析的有核细胞，用流式细胞仪(美国BD公司)收集细胞，每支试管用配套的CellQuest软件分析细胞标志。根据原始细胞上抗原是否跨系表达、表达不同步(不同阶段的抗原同时表达)、表达过强、表达过弱、丢失等判定是否为MRD，MRD≥0.01% 为阳性，否则为阴性。

2.骨髓细胞形态学检测 骨髓液涂片6～8张，经吉姆萨-瑞士染色后，在日本OLYMPAS显微镜油镜下分类200个细胞，根据形态进行不同阶段的分类计数。根据张之南等[3]主编的《血液病诊断及疗效标准》(第3版)判断疗效是否为复发。

三、治疗方案

AML(非M3)的诱导化疗方案采用柔红霉素加阿糖胞苷、去甲氧柔红霉素加阿糖胞苷或米托蒽醌加阿糖胞苷方案。骨髓达完全缓解后采用原方案巩固强化治疗2个疗程，然后分别用中或大剂量阿糖胞苷治疗，完成4个疗程休息2个月，用柔红霉素加阿糖胞苷和米托蒽醌加阿糖胞苷方案交替治疗2个疗程，每疗程间隔3个月，此后停止化疗，定期随访。ALL治疗:诱导缓解为VDCP方案(长春新碱 2 mg，第 1、8、15、22 天;柔红霉素45 mg/m2，第1天至第3天，第15天至第16天;环磷酰胺1 000 mg/m2，第1、15天;泼尼松每天1 mg/kg，14 d)，完全缓解后进入巩固强化治疗。

71例AL患者在诱导化疗结束获得完全缓解后开始随访，至复发随访结束，未复发随访至今，随访时间1～24个月，中位数16个月。

四、统计学方法

应用SPSS 13.0软件对数据进行分析，计数资料以百分率(%)表示，组间比较用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、FCM检测AL患者外周血MRD

以FAB分型骨髓形态学作为判断复发的金标准;部分患者定期接受多次检查，外周血MRD结果以首次结果为准。FCM检测外周血MRD对提示AML和ALL复发的敏感性和特异性见表1。

表1 FCM检测外周血MRD对提示AL复发的敏感性和特异性 [例(%)]

二、外周血 MRD阴性组与阳性组复发率比较

12例外周血MRD阴性组中有3例(25.0%)患者复发，59例外周血MRD阳性组中有44例(74.6%)复发，MRD阳性组复发率明显高于MRD阴性组(P＜0.05)。外周血MRD阴性组与阳性组在24个月随访期间的复发率比较见图1。

三、高低外周血MRD水平复发率比较

59例AL患者外周血MRD定量值按高MRD水平(≥10－2)和低 MRD水平(＜10－2)分成 2组，高MRD水平组38例，低MRD水平组21例。2组复发例数分别是37例(97.4%)和10例(47.6%)。高MRD水平组复发率明显高于低MRD水平组(P ＜0.05)。

图1 外周血MRD阴性组与阳性组复发率比较

讨 论

多参数FCM的免疫分型对MRD的检测已成为研究AL的基本手段，并为AL的诊断、治疗及预后判断提供重要依据。赵利东等[4]研究提出诱导治疗能杀死大量的白血病细胞，但尚未彻底清除，少数患者初次诱导缓解时MRD值持续阳性直至复发。是否达到完全缓解以及缓解的程度是影响患者预后的重要参数之一。临床上对AL治疗效果的评价主要通过骨髓细胞形态学检查，其具有一定的局限性，骨髓穿刺取材只能反映一部分的骨髓情况。采用骨髓细胞形态学诊断标准一般在体内白血病细胞数超过1%时方能检测到，而体内MRD的持续存在会导致患者最终白血病的复发。从患者角度出发，反复骨髓穿刺难以接受，而外周血取材方便，采集外周血无疑更合适。为此，我们针对AL患者的骨髓和外周血标本进行检测分析，探讨FCM检测外周血白血病细胞在AL复发的临床价值。

我们用FCM检测了71例AL患者的外周血MRD，发现外周血MRD与患者的预后有明显的相关性。FCM检测AL患者的外周血MRD对提示AL复发具有较高的敏感性，AML组与ALL组的敏感性分别为96.6%和88.9%。MAURILLO等[5]将外周血作为 MRD的检测对象，结果显示外周血MRD同样与AML患者的长期预后相关，提示外周血循环原始细胞的存在可能与骨髓中的白血病细胞的持续存在有关。本研究中有15例外周血MRD阳性但骨髓形态学检查未达到复发的程度，这就提示此部分患者需要进一步追踪观察，以便采取下一步治疗方案。MRD是一个强烈提示缓解和复发的预后因素。临床应用MRD检测可有效指导完全缓解后的治疗，根据MRD的水平进行预后分级及选择相应的化疗方案等。若MRD持续阴性，可停止治疗;若MRD持续阳性，应给予患者更强的化疗，或考虑骨髓移植。朱勇梅等[6]对骨髓和外周血中MRD水平比较发现，两者会因检测时间、疾病亚型和治疗方案的不同而有所不同，但存在一定的比例关系。BUCCISANO等[7]认为外周血的检测同骨髓一样有意义，如果同时检测外周血及骨髓，可能提高检出率。如果巩固化疗后外周血的MRD水平高于0.015%，复发概率增加。外周血白血病细胞水平可间接反映骨髓情况，用于治疗监测。COUSTAN-SMITH 等[8]研究结果显示，在 T-ALL骨髓与外周血MRD有很好的一致性，外周血可以用于检测MRD;而在B-ALL，骨髓MRD检出率高于外周血，但用外周血检测MRD可以提供强大的预后信息。

本研究中12例外周血MRD阴性组复发率为25.0%，59例外周血 MRD阳性组复发率为74.6%，MRD阳性组复发率明显高于MRD阴性组，结果与文献[9]相近。国外研究提出，在巩固治疗后用FCM检测患者的MRD，结果发现每一个危险层的MRD阳性患者与阴性患者在无病生存率和总生存率上都有显著差异。MRD阳性患者总的复发率为74%，而MRD阴性患者的复发率仅为 27%[10]。PAWINSKA等[11]认为诱导缓解末 MRD≥10－4的患者需要在治疗过程中严密监测MRD的变化，以便及时采取有效的治疗措施。

本研究表明，高MRD水平组复发率明显高于低 MRD水平组。张芳等[12]研究结果表明，FCM检测的MRD水平与复发明显相关。童春容等[13]提出，大多数AL为中等危险性患者，而且即使是一些低危险性AL患者化疗后也会复发，尤其是成年白血病患者，化疗后的复发率仍较高。因此需要更多的预后及检测疗效的指标，帮助指导更加个体化的治疗。

综上所述，FCM检测外周血白血病细胞能很好地提示复发，且外周血取材方便，创伤性相对较轻，对诊断AL复发及指导个体化治疗有重要意义。

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[3]张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].3版.北京:科学出版社，2007:131-133.

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[6]朱勇梅，陈赛娟.微小残留病检测方法及其临床应用[J].中国实验血液学杂志，2005，13(6):1131-1136.

[7]BUCCISANO F，MAURILLO L，DEL PRINCIPE MI，et al.Prognostic and therapeutic implications of minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia[J].Blood，2012，119(2):332-341.

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[13]童春容，王卉，杨君芳，等.流式细胞术定期监测微量残留病可预测急性白血病复发——单中心163例研究[J].中华血液学杂志，2011，32(11):748-751.