HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者HBV基因型分布及其与抗病毒治疗疗效的关系

郑卫波，许文芳，李烨佳

(绍兴市第六人民医院检验科，浙江绍兴312000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染具有明显的地理差异，HBV基因异质性可以影响乙型肝炎的临床和流行病学特点、疾病的预后、抗病毒治疗的应答以及病毒的变异，从而使乙型肝炎的防治面临巨大的挑战。本研究采用型特异性聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，对绍兴地区抗病毒治疗的乙型肝炎病毒e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者的HBV基因型流行情况进行初步调查，以明确本地区HBV基因型的分布情况，探讨经抗病毒治疗的不同HBV基因型感染者的临床特点，以期为临床诊断及指导临床抗HBV药物治疗提供依据。

材料和方法

一、材料

1.研究对象 122例病例均为2009年1月至2012年6月在绍兴市第六人民医院住院或门诊就诊的 CHB患者，男85例，女 37例，年龄(41.2±18.7)岁，诊断标准依据 2005 年中华医学会肝病学分会与感染病学分会联合修订的《慢性乙型肝炎防治指南》[1]。纳入标准:HBeAg阳性且HBV DNA≥103拷贝/mL。排除标准:排除甲型、丙型、丁型、戊型病毒的感染，排除自身免疫性肝炎、脂肪肝和酒精肝，入组前未使用过核苷类似物和干扰素等抗病毒药物及免疫调节剂。入组的乙型肝炎患者给予拉米夫定100 mg/d口服抗病毒治疗并进行跟踪随访，随访时间为1年，所有患者对拉米夫定均有较好的依从性。慢性乙型轻、中和重度肝炎分类依据2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》[2]。

2.标本采集 使用干燥真空管采集患者空腹静脉血5 mL，将分离的血清按规定的要求冻存在冰箱待测。

3.仪器和试剂 德国ROCHE Lightcycle 480荧光PCR定量仪，美国雅培ARCHITECH I 2000化学发光仪，德国西门子ADVIA 2400生化分析仪，美国BIO-RAD S1000Thermal Cycler PCR仪，德国QIAGEN PyroMark Q96 ID测序仪，丙氨酸氨基转移酶(alanine amino transferase，ALT)、HBeAg及HBV基因测序试剂盒均为原装配套试剂，HBV PCR荧光定量检测试剂盒为湖南圣湘生物技术有限公司产品，HBV DNA提取试剂盒为上海复星医学生物技术有限公司产品，引物由上海英骏生物公司合成。

二、方法

1.血清学检测 采用荧光定量PCR检测HBV DNA，检测按试剂盒操作说明书进行，HBV DNA≥103拷贝/mL判定为阳性。采用化学发光法检测HBeAg，速率法检测ALT。

2.HBV基因分型 采用多对型特异性引物巢式PCR对HBV作基因分型，通过巢式PCR扩增处理，将PCR产物分别在3%琼脂糖凝胶中进行电泳，同时加入低相对分子质量Marker，根据电泳条带的长度来确定基因型，A、B、C、D、E、F 6 种HBV基因分型电泳条带的长度分别为68、281、122、119、167 和 97 bp。

3.HBV耐药基因检测 所有患者在出现拉米夫定耐药后均进行HBV P基因测序，采用焦磷酸测序法，严格按照说明书进行操作，采用PyroMark ID型焦磷酸测序仪配套的分析软件进行序列分析，本研究检测HBV P基因RT区已知的11个耐药基因位点:V173L、T184A/G/I/S/L/F、S202G/V/C/I、N236T、M250V/L/I、M204I/V、L180M、I233V、I169T、A194T/M 和 A181V/T。

三、统计学方法

所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示，组间比较采用独立样本t检验，计数资料组间比较采用 χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、122例CHB患者基因分型情况

122例拉米夫定抗病毒治疗的CHB患者中，B基因型 34例(27.87%)，C基因型 82例(67.21%)，D 基因型3 例(2.45%)，C/D 混合基因基因型1例(0.82%)，B/C混合基因型2例(1.64%)，无其它基因型存在。

二、B、C基因型与年龄、性别、传播途径的关系

C基因型感染者年龄为(42.85±12.31)岁，B基因型感染者年龄为(42.53±14.55)岁，两者差异无统计学意义(t=0.14，P＞0.05)。82例 C基因型感染者中男62例，女20例，34例B基因型感染者中男27例，女7例，其它基因型感染者男5例，女1例，B基因型组与C基因型组比较，性别差异无统计学意义(χ2=0.20，P ＞0.05)。82例C基因型感染者中，明确有乙型肝炎家族史者56例，传播途径不详者26例，B基因型感染者中明确有家族史者19例，其它传播途径不详者15例。

三、HBV基因型与临床表现分析

抗病毒治疗后CHB患者中，轻度CHB在B、C基因型感染者中分别占 44.12%和14.63%(χ2=11.7，P ＜ 0.01);中度 CHB 在B、C基因型感染者中分别占 11.76%和19.51%(χ2=1.01，P ＞0.05)，重度 CHB 在B、C基因型感染者中分别占 11.76%和13.41%(χ2=0.06，P ＞0.05);肝硬化代偿期在B、C基因型感染者中分别占 17.65% 和17.07%(χ2=0.01，P ＞0.05)，肝硬化失代偿期在B、C基因型感染者中分别占11.76% 和30.49%(χ2=4.49，P ＜0.05);肝癌在 B、C 基因型感染者中分别占 2.94%和 4.88%(χ2=0.219，P ＞0.05)。见表 1。

表1 CHB患者HBV基因型与临床表现的关系 (例)

四、B、C基因型感染者血清HBeAg转阴率、ALT复常率及HBV DNA转阴率的比较

122例患者中由于B、C基因型以外的其它基因型例数较少，故不将其它基因型纳入分析比较。经统计分析，B基因型感染者HBeAg转阴率、HBV DNA转阴率显著高于C基因型感染者(χ2=8.04、11.9，P 均 ＜0.01)，ALT 复常率高于C基因型感染者，但差异无统计学意义(χ2=1.62，P ＞0.05)。B、C 基因型感染者治疗前血清HBV DNA水平差异无统计学意义(t=0.89，P=0.38)。抗病毒治疗 1 年后，B基因型感染者HBV DNA载量显著低于C基因型感染者(t=2.71，P=0.022)。见表 2、表 3。

五、抗病毒治疗后HBV P基因变异分析

B基因型感染者抗病毒治疗1年内HBV P基因发生变异0例，C基因型感染者发生变异4例，检测到rtM204I/V、rtL180M单位点的变异，其中检出 rtM204I/V突变2例，占50%，rtM204I/V+rtL180M突变2例，占50%，其它基因型感染者有1例发生rtM204I/V+rtL180M突变，B基因型和C基因型感染者1年内HBV P基因变异率差异无统计学意义(χ2=1.71，P ＞0.05)。

表2 不同HBV基因型感染者HBeAg转阴率、ALT复常率的比较

表3 不同HBV基因型感染者治疗前后HBV DNA检测结果

讨 论

根据HBV基因序列不同，目前HBV可分为A～J共10种基因型[3-4]。我国HBV基因型南方以B基因型为主，北方以C基因型为主，D基因型仅见于西部及少数民族地区。本研究结果发现122例抗病毒治疗的CHB患者主要以C基因型和B基因型为主，C基因型占优势，并出现了一定比例的D基因型，这与北京地区HBV基因型分布情况基本相似[5]，这可能与入选治疗标准有关，而D基因型的出现，可能是西部及少数民族人口向东部沿海城市流动增强所致。

有学者对亚洲地区普遍流行的B基因型和C基因型作了大量研究，结果显示，与B基因型相比，C基因型患者HBeAg血清转换率低[6]，CHB病情重，发展为肝硬化和肝癌的可能性亦较大[7]。本研究发现，B基因型患者以轻度CHB为主，C基因型患者以失代偿期肝硬化为主，提示B基因型的预后好于C基因型;与以往文献报道有所差异的是，本研究中82例C基因型和34例B基因型患者中肝癌所占比例均较少，且差异无统计学意义，这可能一方面与入选的病例有关，另一方面可能是CHB患者早期积极的抗病毒治疗在一定程度上抑制了疾病的发展。数据显示B基因型感染患者抗病毒治疗1年后不仅HBV DNA转阴率、HBeAg转阴率以及ALT复常率均高于C基因型，而且HBV DNA载量显著低于C基因型感染患者，说明B基因型较C基因型具有较强的免疫应答能力，C基因型病毒致病性强，容易导致感染者免疫耐受。同时我们还发现，其它基因型组中HBV DNA转阴率、HBeAg转阴人数以及ALT的复常率均较低，6例患者中有3例为混合基因型，而混合感染者较单一基因型感染严重，可能2种基因对肝脏的损害具有协同累加作用[8]。

国内外一些研究表明，HBV基因异质性与疾病进展及药物应答有相关性，基因B型HBV对拉米夫定的应答率优于C型，而YMDD变异发生率低于 C型，认为 YMDD变异呈现基因选择性[9-10]。本研究的34例B基因型和82例C基因型患者抗病毒治疗1年后，B基因型无1例发生病毒变异，而C基因型有4例发生了基因突变，两者差异无统计学意义(P＞0.05)，此结果与石铭等[11]的报道基本相同。有文献报道拉米夫定耐药株感染者基因型与YMDD变异模式无关[12]，而与变异位点具有一定的相关性[13]。本研究显示，HBV P位点突变主要在204、180位点，并出现高比例联合突变，表明rtM204I/V是拉米夫定耐药性相关的主要突变位点，且多伴随rtL180M的联合突变，这与卢丹等[13]耐药突变分析结果大致相似。

拉米夫定抗病毒药物是临床上使用较早和较广泛的核苷类药物，所以加强对HBV基因型分布特征和抗病毒疗效的研究，有助于预示病毒未来的变异和发展方向，为制定更加有效的防控措施提供指导。

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