子痫前期孕妇孕早期血清miR-520g表达分析

厉 倩，龙安雄，洪 茂，蔡雷鸣，谢 骊，顾继安，谭龙益

(上海市第一人民医院宝山分院检验科，上海200940)

子痫前期(preeclampsia，PE)是一种常见的孕妇多系统紊乱综合征，是孕妇和胎儿发病率和病死率最高的疾病之一[1]。胎儿分娩和胎盘剥离是目前PE唯一的治愈手段，如早期对高危孕妇进行干预，对减少子痫的发生及减轻其危害具有一定的价值。到目前为止，PE的病因和病理学机制尚不清楚，且缺乏理想的预测和早期诊断指标。2007年LIANG等[2]发现了胎盘特异性微小RNA(microRNA，miR)，随后胎盘特异性miR被证实在孕期血浆/血清中稳定存在，循环胎盘特异性miR可能是妊娠相关疾病的良好生物标志物。本研究利用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测 PE患者和正常对照不同孕期血清中胎盘特异性miR-520g的表达量，探讨血清miR-520g对孕妇PE是否具有一定的预测价值。

材料和方法

一、研究对象

本研究纳入了2011年1月至2013年12月在上海市第一人民医院宝山分院分娩的30例PE患者和30名无明确妊娠相关疾病产妇。PE的诊断标准依据第7版妇产科学[3]，即妊娠20周后收缩压≥18.7 kPa和/或舒张压≥12.0 kPa伴蛋白尿≥0.3 g/24 h，或随机蛋白尿阳性。所有研究对象都是单胎妊娠，对照组和病例组的年龄、孕前体重指数(body mass index，BMI)没有显著差异，具体临床特征见表1。30名正常妊娠者全部完成了孕早期(12～14周)、孕中期(20～24周)和孕晚期(28～32周)血液样本的收集，30例PE患者收集孕早期血液样本14例、孕中期血液样本30例、孕晚期血液样本30例。

表1 研究对象临床特征

二、样本采集、处理及保存

用分离胶真空采血管采集空腹血液样本3～5 mL，静置20 min后以1 200×g离心10 min。首次离心后收集上清并高速(12 000×g)离心10 min，转移上清于无RNA酶的无菌Eppendorf管中，－80℃冻存备用。

三、RNA抽提

利用miRNeasy Serum/Plasma kit(Qiagen)提取血浆/血清总 RNA，说明书具体步骤如下:在200μL血浆/血清中加入1 mL的Qiazol溶解液，充分混匀后室温放置 5 min加入 3.5μL Cel miR-39(1.6×108/μL，Qiagen)作为内参，加入200μL氯仿，充分混匀后室温放置3 min，置低温离心机(Sigma)内 12 000×g离心 15 min，将550μL上层澄清萃取液转移到新的1.5 mL无菌Eppendorf管中，加入1.5 倍(825μL)的无水乙醇，充分混匀，分2次将混合液过洗脱柱，弃去滤过液，洗脱柱分别用700μL RWT、RPE缓冲液和80%乙醇溶液洗涤，末次洗涤后洗脱柱高速(12 000×g)离心5 min以干燥柱内膜，最后加入14μL无RNA酶水洗脱总RNA。

四、cDNA第一链合成

利用miScriptⅡ逆转录试剂盒(Qiagen)合成cDNA第一链(加尾法)，具体如下:150μL PCR反应管中加入2μL10×RT mix，2μL10×nucleics mix，8μL无RNA酶水，4μL 5×hispec Buffer和4μL总RNA，充分混匀并低速(1 200×g)离心1 min后置于扩增仪(Bioer)中，36℃1h，95℃5min。

五、荧光定量PCR

利用miScirpt SYBR green PCR试剂盒(Qiagen)和ABI7500扩增仪进行荧光实时定量。反应体系如下:10μL 2×master mix，2μL 10×通用引物，2μL 10×特异性引物，4μL 无 RNA 酶水和2μL 100倍稀释的cDNA模板。扩增条件如下:95 ℃变性15 min，94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃34 s，延伸阶段采集荧光信号，共40个循环。内参基因选择RNA抽提过程中加入的Cel miR-39。Cel miR-39和miR-520g在2孔中进行扩增。每个标本都做3个平行复孔，取Ct平均值。所有荧光定量PCR在96孔反应板内进行，单个标本miR-520g的表达量用相对miR-39的Ct差值表示。差异表达的相对定量分析用2－ΔΔCt法。

六、统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件包进行统计学分析。组间miR-520g的比较用Mann-Whitney U检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。miR-520g在各组的表达量用箱图来表示。

结 果

一、正常妊娠组孕早、中、晚期血清miR-520g表达量的变化

在正常妊娠组，血清miR-520g的表达量随着孕程进展有逐步升高的趋势，见图1，孕中期(孕20～24周)、孕晚期(孕28～32周)的 miR-520g表达量显著高于孕早期(孕12～14周)，孕晚期miR-520g表达量高于孕中期，但差异无统计学意义(P ＞0.05)。

图1 正常妊娠组不同孕周血清miR-520g表达量

二、PE患者早、中、晚期血清miR-520g表达量

PE患者孕早期miR-520g表达量显著高于正常妊娠照组，而孕中期和孕晚期miR-520g的表达量在两组间差异无统计学意义(P＞0.05)。见图 2。

图2 PE患者与正常妊娠者不同孕周血清miR-520g相对表达量的比较

讨 论

miR是一类全长为19～25个核糖核苷酸的非编码调控单链小分子RNA，由一段具有发卡环结构的单链RNA前体剪切后生成，通过与目标mRNA分子的3'-端非编码区域(3'-UTR)互补配对使目标mRNA分子的翻译受到抑制，从而在转录后对靶基因的表达水平进行调控。生物信息分析显示只占了人类基因组1%～3%的miR调控着高达30%的人类基因。在不同组织及不同发育阶段，不同miR的表达水平有显著差异。近年的研究表明miR在细胞增殖、分化、凋亡，肿瘤形成，心血管疾病等生理和病理过程中都有非常重要的作用[4]。自 2008年MITCHELL等[5]在人血清/血浆中稳定检测到肿瘤来源的miR以来，循环miR作为生物标记物受到越来越多的关注。

PE是一种常见的妊娠相关疾病，是孕妇和胎儿发病率和病死率最高的疾病之一[1]。主要表现为在怀孕20周后出现高血压和蛋白尿，部分患者出现水肿、头痛，严重者发生子痫、肝肾功能和凝血障碍、成人呼吸窘迫综合征和胎儿发育障碍等，发生过子痫的孕妇其后患高血压、心血管疾病的风险也大大增加。胎儿分娩和胎盘剥离是目前唯一的治愈手段，但早期对高危孕妇进行干预，对减少子痫的发生及减轻其危害具有一定价值。血清可溶性血管内皮生长因子受体1(soluble vascular endothelial growth factor receptor-1，sFlt-1)、胎盘生长因子(placental growth factor，PLGF)水平等可能在PE的预测中有一定价值[6]，但目前尚无有效、可靠和经济的预测方法。近年来多项研究指出PE胎盘中存在异常表达的miR，如 miR-210、miR-1、miR-181a、miR-584 等，这些异常表达的miR可能通过调节相应的靶基因，调节滋养细胞的迁移和血管的重塑，从而在PE的病理过程中发挥重要作用[7-9]。这些在胎盘中异常表达的miR部分被证实在血清/血浆中也有异常表达[10]，但胎盘和循环 miR的结果并不总是一致，有时甚至相反，不同的妊娠时期血清中的miR也处于动态变化中，本研究结果也显示miR-520g表达量在正常妊娠过程中随孕周逐步升高。

在PE胎盘异常表达的miR中有一类胎盘特异性miR，他们在胎盘以外的其它组织中表达很少甚至没有，而在胎盘中表达丰度较高。胎盘特异性 miR多来自 19号染色体，如 miR-517a、519d、520g、520h 等[2]。由于不受其它组织疾病的影响，胎盘特异性miR表达谱可能在妊娠相关疾病的预测、诊断中有重要价值。本研究检测了30例单胎妊娠的健康孕妇不同孕期血清中miR-520g的表达量，发现循环miR-520g在正常妊娠组的表达量随孕周逐步上升，这可能与胎盘组织的逐渐增大相关，与HROMADNIKOVA等[11]报道的关于miR-516、miR-517等胎盘特异性miR的结果一致。我们进一步检测了30例单胎妊娠的PE患者不同孕期血清miR-520g的表达量，发现PE患者孕早期的miR-520g表达量异常上调，而孕中、晚期的miR-520g表达量与正常妊娠组无明显差异，这可能与孕早期胎盘螺旋动脉重塑过程有关。胎盘浅着床和子宫螺旋动脉重塑不良被认为是PE发生的重要病理机制，螺旋动脉重塑主要发生在孕12～20周。生物信息分析发现胎盘特异性 miR-520g的靶基因中有 ephrin b2(EFNB2)及其受体ephrin receptor b4(EPHB4)，而EFNB2/EPHB4被认为在血管形成、胎盘发育及螺旋动脉重塑过程中都具有重要作用[12]，但miR-520g与EFNB2/EPHB4的关系有待进一步实验来证实。

本研究首次报道了正常妊娠及PE患者不同孕期血清胎盘特异性miR-520g的表达量，发现孕早期miR-520g可能对PE的早期预测有一定的价值。miR-520g如何参与PE的发生和发展、血清miR-520g表达量与PE严重程度的相关性等值得更深入的研究来进一步论证，这将有助于PE病理机制的阐明和防治。

[1]YOUNG BC，LEVINE RJ，KARUMANCHI SA.Pathogenesis of preeclampsia[J].Annu Rev Pathol，2010，5:173-192.

[2]LIANG Y，RIDZON D，WONG L，etal.Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues[J].BMC Genomics，2007，8:166.

[3]乐杰.妇产科学[M].7版.北京:人民卫生出版社，2009:92-101.

[4]BARTEL DP.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function [J].Cell，2004，116(2):281-297.

[5]MITCHELL PS，PARKIN RK，KROH EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(30):10513-10518.

[6]袁小松，张一鸣，蒋雅琴，等.血清可溶性血管内皮生长因子受体1/胎盘生长因子比值作为预测子痫前期患病风险的价值[J].检验医学，2010，25(10):784-786.

[7]PINELES BL，ROMERO R，MONTENEGRO D，et al.Distinct subsets of microRNAs are expressed differentially in the human placentas of patients with preeclampsia[J].Am J Obstet Gynecol，2007，196(3):261.e1-261.e6.

[8]ZHU XM，HAN T，SARGENT IL，et al.Differential expression profile of microRNAs in human placentas from preeclamptic pregnancies vs normal pregnancies[J].Am J Obstet Gynecol，2009，200(6):661.e1-661.e7.

[9]ENQUOBAHRIE DA，ABETEW DF，SORENSEN TK，etal. PlacentalmicroRNA expression in pregnancies complicated by preeclampsia[J].Am J Obstet Gynecol，2011，204(2):178.e12-178.e21.

[10]YANG Q，LU J，WANG S，et al.Application of next-generation sequencing technology to profile the circulating microRNAs in the serum of preeclampsia versus normal pregnant women[J].Clin Chim Acta，2011，412(23-24):2167-2173.

[11]HROMADNIKOVA I，KOTLABOVA K，DOUCHA J，et al. Absolute and relative quantification of placenta-specific micrornas in maternal circulation with placental insufficiency-related complications[J].J Mol Diagn，2012，14(2):160-167.

[12]MOSCH B，REISSENWEBER B，NEUBER C，et al.Eph receptors and ephrin ligands:important players in angiogenesis and tumor angiogenesis [J].J Oncol，2010，2010:135285.