菘蓝色氨酸合成酶基因的克隆与生物信息学分析

杨 树，潘淑琴，张丽红，王喆之，李 焘

（药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，西北濒危药材资源开发国家工程实验室，陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安 710119）

菘蓝（IsatisindigoticaFort）是十字花科（Cruciferae）菘蓝属（Isatis）两年生草本植物，主要分布在河北、江苏、浙江、安徽等地；具有清热解毒、凉血消斑的功效，是板蓝根、大青叶药材及其制剂的主要来源［1］；其有效成分包括生物碱类、有机酸类、氨基酸类、喹唑酮类、芥子苷类及腺苷、多糖等，其中靛蓝为菘蓝主要的次生代谢产物之一，靛玉红是靛蓝的同分异构体.

关于靛蓝在植物体内的合成过程一直都是植物学家关注的热点和难点.目前，微生物合成靛蓝的过程已经十分明确，而大量的文献研究也表明，植物中靛蓝的合成过程与微生物相类似［1］.由色氨酸合成途径产生的吲哚-3-甘油磷酸（indole-3-GP）在色氨酸合成酶（TSA）的催化下形成靛蓝的起始物质吲哚［2］；吲哚在细胞色素P450单加氧酶（CYP）的催化下 形 成 吲 哚 酚［3］；吲 哚 酚 在 β-D-葡 萄 糖 苷 酶（GLU）的催化下形成一系列靛蓝的前体物质［4］，并最终合成靛蓝类色素物质.因此，色氨酸合成酶（TSA）在靛蓝合成过程中扮演了十分重要的角色［5－6］.

目前，关于菘蓝中靛蓝合成途径催化各步反应的关键酶及其编码基因的功能研究鲜见报道，极大地限制了利用生物技术手段提高靛蓝合成效率的进程.因此，有必要深入开展菘蓝分子生物学的研究，阐明相关基因在靛蓝类色素物质合成乃至其他一些次生代谢产物的合成、积累及调控过程中的重要作用.为此，我们以菘蓝转录组数据为基础，以菘蓝为研究对象，克隆菘蓝色氨酸合成酶基因，并对其进行生物信息学分析，以期进一步明确其生物学功能.

1 材料与方法

1.1 材料

菘蓝种子:采自陕西师范大学校园内，种于含蛭石的营养钵中，放于人工气候箱（宁波江南仪器厂，RXZ-500D）中培养（温度25±2℃，湿度48%，光照强度216μmol/（m2·s），光照时间16h/d）.

菌株与载体:大肠杆菌DH5α；PMD 19-T Simple Vector购自TaKaRa Biotechnology公司.

试剂与药品:植物基因组DNA提取试剂盒；DNA凝胶回收试剂盒；DL2000，2×Taq PCR Master Mix，ddH2O；LB培养基（固、液体），1×TAE缓冲液，溴化乙锭（EB），氨苄青霉素等.

1.2 实验方法

1.2.1IiTSA引物的设计 采用本实验室已经建立的菘蓝转录组数据库信息，利用DNAStar软件寻找菘蓝色氨酸合成酶Unigene序列的开发阅读框，发现该Unigene序列具有完整的开放阅读框.经NCBI氨基酸比对发现，该Unigene为cDNA全长，比对结果如图1所示.

图1 已知Unigene序列氨基酸比对结果Fig.1 Unigene known amino acid sequence alignment results

利用软件Primer premier 5.0在已知Unigene序列的开放阅读框之外设计引物TSA-R:5′-TGCAGTATCCATAGCTTCTTAC-3′， TSA-F:5′-CACAATCAA GAATGATTTCTGC-3′，并 合 成（北京奥科鼎盛生物科技有限公司）［7－8］.

1.2.2 菘蓝基因组DNA的提取 参照Biospin植物基因组DNA提取试剂盒进行.

1.2.3 菘蓝色氨酸合成酶基因的克隆IiTSA的克隆主要包括PCR的扩增、扩增产物的电泳检测、凝胶回收、T载体的连接、回收产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞以及阳性克隆的挑选等过程.

1.2.4 菘蓝色氨酸合成酶基因的生物信息学分析

利用 DNAStar软件和 http://www.ncbi.nlm.nih.gov./；http://www.ebi.ac.uk/；http://psort.hgc.jp/；http://www.cbs.dtu.dk/；http://cn.expasy.org/等网站提供的各类生物信息学分析软件对菘蓝色氨酸合成酶基因的核酸序列和编码的氨基酸序列进行在线分析［7］.开放阅读框的查找、核酸序列和氨基酸序列的组成、蛋白质的理化性质、亲水性/疏水性、信号肽、跨膜结构域、亚细胞的定位、二级结构和三级结构的分析分别用DNAStar软件和 在 线 工 具 ClustalW2、BlastX、ExPASy Prot-Param、ProtScale、SignalP 3.0Server、TMHMM、PSORT、SOPMA和ESyPred3D进行分析.核酸序列和氨基酸序列的同源性分别用Blast和ClustalW2进行分析.

2 结果与讨论

2.1 IiTSA的克隆和结构分析

根据已知的Unigene到NCBI进行比对，该Unigene为cDNA全长，利用DNAStar5.0寻找cDNA的开放阅读框，在开放阅读框外设计引物，以菘蓝基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得该基因的全长.分析发现，cDNA全长1 035bp，包含5′端非编码区42bp、3′端非编码区57bp和一个936 bp的开放阅读框，编码311个氨基酸；IiTSA全长为2 111bp，包括8个外显子和7个内含子，这与欧洲菘蓝和玉米一样［5－6］，且每个内含子的两端具有内含子的保守序列GT/AG，符合典型的GT-AG规则（见图2）.利用在线工具ExPASy Protparam预测显示:IiTSA编码的氨基酸序列分子量为32.922 1 kDa，理论等电点6.76.经在线工具PSORT分析，IiTSA定位在叶绿体基质中的可能性最大，这与拟南芥中TSA的定位一致［7］.

图2 IiTSA的全长及其推导的氨基酸序列Fig.2 DNA sequence of IiTSAand the deduced amino acid

2.2 IiTSA的疏水性/亲水性分析

疏水性是指氨基酸远离周围水分子，包埋进蛋白质核心的相对趋势，是蛋白质三维空间构象的影响因素之一［9］.疏水性和亲水性的分析，对蛋白质高级结构的预测和功能结构域的分析有重要意义.用在线工具Protscale对IiTSA氨基酸序列的疏水性和亲水性进行预测，结果如图3所示.75～175之间为明显的疏水区域，270～280之间疏水性最强，无明显的亲水区域，整条肽链表现为疏水性.再经Ex-PASy ProtParam预测显示IiTSA编码的氨基酸GRAVY（Grand Average of Hydropathicity，即总平均亲水性）值为0.117，因此，IiTSA为疏水蛋白.

图3 IiTSA疏水性/亲水性的预测Fig.3 Predicted hydrophobicity/hydrophilicity of IiTSA

2.3 IiTSA信号肽分析

信号肽是与蛋白分选相关的信号序列，均含有一段或几段特殊的氨基酸序列，可用于引导蛋白质进入细胞的特定部位，通常位于蛋白质的氨基端，一般由15～30个氨基酸残基组成，在信号肽的中部有一段疏水核心区［10］.信号肽的预测和分析，对分析和理解蛋白质在细胞中的定位及分选有着重要的参考价值.用SignalP 3.0Server对IiTSA氨基酸序列的信号肽进行预测，结果如图4所示.分析结果发现IiTSA不具有信号肽.据此推测，IiTSA合成后，不进行蛋白质的转运，直接在合成部位发生作用.

图4 IiTSA信号肽的预测Fig.4 Predicted signal peptide of IiTSA

2.4 IiTSA跨膜结构域预测

跨膜结构域是内在膜蛋白与膜脂相结合的主要部位，一般由20个左右的疏水氨基酸残基组成，形成α螺旋（长度约3.2nm），其外部疏水侧链通过范德华力与脂双层分子脂肪酸链相互作用［10］.跨膜结构域的预测和分析，有助于分析蛋白质的结构、种类、功能和定位.用TMHMM2.0Server对TSA氨基酸序列的跨膜结构域进行预测，结果如图5所示.IiTSA具有跨膜结构域的可能性很小，推测不具跨膜结构域，不属于跨膜蛋白.

2.5 IiTSA高级结构预测

蛋白质的高级结构决定了其生物学功能，而高级结构又取决于蛋白质的氨基酸序列.多肽链借助氢键排列成沿一维方向有规则的二级结构，二级结构借助范德华力、氢键、离子键和疏水作用等形成蛋白质的三级结构，从而发挥正常的生物学功能［10］.因此，蛋白质高级结构的预测和分析，对认识蛋白质结构和功能之间的关系有着重要意义.用SOPMA对IiTSA氨基酸序列的二维结构进行预测，结果表明，IiTSA由43.41%的α－螺旋、16.72%的延伸链、7.72%的β－转角和32.15%的无规则卷曲构成.从整个蛋白质的结构分析，α－螺旋和无规则卷曲是IiTSA的主要结构元件，β－转角和延伸链散布于整个蛋白质.

氨基酸序列相似的蛋白质，它们的三维结构也相似［11］.用ESyPred3D在线同源建模法构建IiTSA的三级结构，结果见图6.该模型以玉米中的BX1（吲哚合酶）的三维结构为模板构建，二者的相似性为50.8%，其结构模型显示，整个三级结构呈“桶状”，IiTSA主要由10个α－螺旋和一些无规则卷曲构成，这与二级结构的预测结果一致.

图6 IiTSA三维结构的预测Fig.6 Predicted the three dimensional structure model of IiTSAby Esypred 3D

图5 IiTSA跨膜结构域的预测Fig.5 Predicted transembrane domain by TMHMM 2.0sever

2.6 不同物种间TSA的核酸序列及其推导的氨基酸序列的同源性分析

运用NCBI上的Blastn程序对IiTSA的核酸序列进行比对.比对结果表明，IiTSA的核酸序列和欧洲菘蓝（Isatistinctoria，AJ841705.1）、拟南芥（Arabidopsisthaliana，U18993.1）的一致性较高，分别为96%、87%；用Blastp程序以及在线工具ClustalW2对IiTSA编码的氨基酸进行序列同源性分析，结果显示IiTSA编码的氨基酸与多种植物TSA编码的氨基酸序列均具有较高同源性（见图7），与欧洲菘蓝（Isatistinctoria，CAH56477）、拟南芥（Arabidopsisthaliana，AAM65526）、琴叶拟南芥 （Arabidopsislyratasubsp.lyrata，XP ＿002877992）、蓖 麻 （Ricinuscommunis，XP ＿002520975）、玉米（Zeamays，NP＿001123592）、花生（Arachishypogaea，ABI84259）等的一致性分别为:98%、92%、90%、72%、69%、75%，其 中 与 欧 洲菘蓝的同源性最高达98%，说明本次实验克隆出的基因确实为菘蓝色氨酸合成酶基因.

3 结论

色氨酸是菘蓝中靛蓝合成的基础，而色氨酸合成酶是菘蓝中靛蓝合成过程中的关键酶，目前关于色氨酸合成酶基因的研究还较少，在植物中仅见于拟南芥、欧洲菘蓝、玉米等.本实验根据已知Unigene利用PCR技术获得了IiTSA全长，它与同属植物欧洲菘蓝和玉米一致，与拟南芥等物种中色氨酸合成酶基因的长度接近，且有较高的一致性.IiTSA的克隆和功能分析可为进一步揭示靛蓝次生代谢途径奠定基础.

图7 菘蓝TSA与其他几种植物的TSA的同源性比对Fig.7 Homology alignment in IiTSAand other species

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