基于表面等离子体共振传感器的尿微量白蛋白检测*

陈萌梦，熊兴良，李 广，张婷婷，陈 镇

（重庆医科大学生物医学工程研究室，重庆 400016）

0 引言

尿微量白蛋白（U-albumin，MAU）是指在尿中出现超出健康人群参考范围的人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）。正常情况下，绝大部分白蛋白被肾小管重吸收重新进入血液，尿液中仅残存少量的白蛋白。当肾小球病变时，HSA滤过量增多，不能被肾小管全部重吸收而从尿中排出，形成MAU。当尿中白蛋白的排泄率1min超过20mg或24 h超过30 mg，尿液白蛋白浓度为30～200 mg/L，即形成用常规方法无法检出的白蛋白尿。MAU是诊断早期或轻微肾脏损害的敏感指标，也是高血压患者发生心脑血管事件的独立预测因子［1］。目前，测定MAU的方法有很多，如放射免疫法［2］、ELISA 法［3］、高效液相色谱法［4］、免疫透射比浊法［5］等。放射免疫法操作复杂，存在放射性污染;ELISA法的检出率较低;高效液相色谱法处理过程复杂，需要生化仪;免疫透射比浊法作为目前应用最普遍的方法，但试剂昂贵，且胆红素对检测的干扰较大。

表面等离子体共振（surface plasmon resonance，SPR）生物传感器基于光学原理，通过入射光与金属表面的等离子发生共振，实时监测抗原抗体的结合程度，而且，该传感器可以根据其动力学特性绘制标准曲线，实现生物分子间相互作用的检测。这种生化分析技术具有实时、直接、免标记等优点，已广泛应用于药物研究，食品分析、环境监测等许多领域［6～8］。近来，人们开始应用信号放大技术提高SPR生物传感器的灵敏度，其中，纳米金（AuNPs）由于具有密度大、介电常数大、高比表面积等优点，极大地增强信号，提高检测灵敏度受到越来越多学者关注［9］。

本文实验部分利用河南农大研制的SPR传感器对MAU的检测方法进行研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

本实验所用的仪器是迅捷测试技术有限公司HPSPR-6000光学SPR生物分析仪。试剂包括:HSA，鼠抗HAS单克隆抗体（monoclonal mouse anti-HSA），NHS（N-hydroxysuccinimide，N—羟基琥珀酰亚胺），EDC（1—ethyl—3—（3-dimethy-laminopropyl）carbondiimide hydrochloride，N—乙基—N'—（二甲氨基丙基）碳二甲胺），MUA（11-mercapto-hexadecanoic acid，16—巯基十六醇），纳米金（10 nm）均购自 Sigma-Aldrich公司;反应的缓冲液为0.1 mol/L PBS，其他试剂为分析纯，尿标本预先用生理盐水30倍稀释测定。

1.2 实验方法

1.2.1 抗—HSA 的固定

在干净的SPR芯片表面滴加10 mmol/L MUA，室温下避光反应24 h，使其表面形成一层巯基自组装单分子层。然后将0.1 mol NHS和0.4 mol/L EDC等体积混合滴于金膜表面反应5 h，交联活化芯片。随后取20 μL抗—HSA滴于芯片表面反应8 h。最后滴加1 mol/L pH=8.5盐酸乙醇胺，封闭多余的羧基。每次芯片处理之前都要用:无水乙醇冲洗干净，并用大量去离子水反复洗，氮气吹干。

1.2.2 检测方法

1）直接检测:将处理后的芯片装入 SPR仪内，以20 μL/min通入稀释到不同浓度（0～100 μg/L）的 HSA 溶液，芯片上的抗体与HSA结合。每次反应以后都要通入4%SDS溶液再生。

2）纳米金放大检测:不同浓度（0～100 μg/L）的HSA与纳米金混合以后，以20 μL/min通入芯片表面5 min。再生方法同上。

2 实验结果

2.1 HSA特异性对照实验

由于人尿液含有血红蛋白、肌酐、胆红素、尿酸等干扰物质会对检测造成影响。本实验取了2组共100例样本，实验组分别是健康组60例（男33例，女27例），均排除高血压、糖尿病及其他和肾病有关病史。糖尿病组，40例（男28例，女12例）。健康组和患者组均分别留取随机尿，并以不同方法测定白蛋白。随后配制与实验组相应浓度的纯的HSA溶液100份作为对照组，均以直接法通入SPR仪中。数据表明:尿液中的干扰物质并没有对响应结果造成影响，这应该与抗体的特异性有关，证明该法可以用于临床检测。

2.2 2种检测法比较

图1（a）显示了不同浓度的HSA通入芯片表面所产生的信号。利用直接检测法可以检测到0.3 μg/L，而固定更多的抗体，对于检测范围和检测限没有明显影响。纳米金放大检测的动态曲线如图1（b）所示，检测限几乎可以达到0.03 μg/L，加入纳米金极大地增强传感器响应信号，最终所得到的总的响应值大约是直接检测所得到的响应值的10倍。分析结果表明:通过这种加入纳米金的方法，可以得到更精确的灵敏度，有效地增强了响应信号，同时，极大地降低了检测限。

图1 不同浓度HSA响应曲线Fig 1 HSA response curve of different concentration

3 结论

本文提出了一种快速检测MAU的生物传感器的方法，该法处理简单，用时短，可实时监测反应进程。但是SPR由于仪器费用较高，仅在少数实验室投入使用，无法实现家用便携式检测。由于SPR芯片的特殊性，对于金膜厚度和样本固定情况不一，存在一定的误差，所以，需要操作的专业性强。目前通过对各个因素的控制，芯片之间的差异可以控制在10% 以内。SPR仪可以实现多通道检测，将样本误差减到最小，重复使用率也明显高于其他生物分析仪器。

［1］LHillege H L，Fidler V，Diercks G F，et al.Urinary albumin excretion predicts cardiovascular and noncardiovascular mortality in general population［J］.Circulation，2002，106（14）:1777-1782.

［2］LMiles D，Mogensen C，Gundersen H.Radioimmunoassay for urinary albumin using a single antibody［J］.Scandinavian Journal of Clinical＆ Laboratory Investigation，1970，26（1）:5-11.

［3］Feldt-Rasmussen B，Dinesen B，Deckert M.Enzyme immunoassay:An improved determination of urinary albumin in diabetics with incipient nephropathy［J］.Scandinavian Journal of Clinical＆ Laboratory Investigation，1985，45（6）:539-544.

［4］Owen W E，Roberts W L.Performance characteristics of an HPLC assay for urinary albumin［J］.American Journal of Clinical Pathology，2005，124（2）:219-225.

［5］Kearney E，Mount J，Watts G，et al.Simple immunoturbidimetric method for determining urinary albumin at low concentrations using Cobas-Bio centrifugal analyser［J］.Journal of Clinical Pathology，1987，40（4）:465.

［6］Yuan J，Oliver R，Li J，et al.Sensitivity enhancement of sprassay of progesterone based on mixed self-assembled monolayers using nanogold particles［J］.Biosensors and Bioelectronics，2007，23（1）:144-148.

［7］Ruemmele J A，Hall W P，Ruvuna L K，et al.A localized surface plasmon resonance imaging instrument for multiplexed biosensing［J］.Analytical Chemistry，2013，85（9）:4560-4566.

［8］Foudeh A M，Daoud J T，Faucher S P，et al.Sub-femtomole detection of 16s rRNA from legionella pneumophila using surface plasmon resonance imaging［J］.Biosensors and Bioelectronics，2014，52:129-135.

［9］Lyon L A，Musick M D，Smith P C，et al.Surface plasmon resonance of colloidal Au-modified gold films［J］.Sensors and Actuators B:Chemical，1999，54（1）:118-124.