阿托伐他汀对人胆管癌QBC939 细胞系侵袭的影响

郑龙志，林 伟，陈有挺，石 铮，何庆良

1.莆田学院附属医院普通外科，福建 莆田351100;2.福建医科大学附属第一医院普通外科

胆管癌是指来源于胆管系统上皮组织的恶性肿瘤，其起病隐匿、缺乏典型的症状和体征，早期诊断困难;临床上根治性切除率低，且对放化疗不敏感，预后较差。因此，探索一条新的有效的治疗途径，对于胆管癌的治疗具有十分重要的意义。他汀类药物的作用具有多效性，它除有降血脂作用外，还具有抗肿瘤方面的作用［1］。本研究旨在研究阿托伐他汀(Atorvastatin，ATV)对QBC939 细胞侵袭的影响，探讨其抗肿瘤作用及其可能的作用机制。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养:用人胆管癌QBC939 细胞进行培养，取处于对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2 体外细胞杀伤实验:应用四唑盐(MTT)比色法进行体外细胞杀伤实验，细胞抑制率(%)=(对照组A 值-治疗组A 值)/对照组A 值×100%;以时间为横轴，细胞抑制率为纵轴绘制药物浓度曲线图，计算出药物半数抑制浓度IC50及药物最佳作用时间。药物IC50为(26.361.84)μmol/L，本实验选用接近IC50的3个浓度作为实验浓度:10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L，并以最佳作用时间48 h 为干预时间。

1.2.3 Matrigel 侵袭实验:取对数生长期QBC939 细胞，用无血清RPMI-1640 培养液洗涤3 次，制成1 ×106个/ml 的单细胞悬液，将上述配制的各组细胞悬液100 μl，分别加入Transwell 小室中，待细胞贴壁后，加入含不同浓度阿伐他汀的培养液，每一浓度设3 个复室，以等量无药液培养液为对照，置入培养箱中培养12 h。取下Transwell 微孔滤膜在4%甲醛液中固定30 min，常规HE 染色。400 倍光镜下观察，随机取5 个高

1 材料与方法

1.1 材料 人胆管癌细胞株QBC939 由第三军医大学王曙光教授建株，董家鸿教授惠赠;Transwell 小室购自Corning 公司;Matrigel 胶购自美国BD 公司。抗体:抗RhoC 多克隆抗体购自Upstate 公司，一步法RTPCR 试剂盒购自美国Invitrogen 公司。倍视野，计数透膜细胞总数。

1.2.4 半定量RT-PCR 分析RhoC mRNA 的表达:参照试剂盒说明书，采用Trizol 法提取细胞总RNA，一步法RT-PCR 扩增目的基因，紫外分光光度计测定RNA 含量。

1.3 统计学处理 采用SPSS 11.5 统计软件进行统计学处理，数据以x ±s 表示，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ATV 对QBC939 细胞的杀伤抑制作用 ATV 对人胆管癌QBC939 细胞的杀伤抑制作用随着药物浓度的增加而增强，在同一药物浓度干预下，杀伤抑制作用随干预时间的延长而渐增;呈剂量-时间双效应关系(见图1)。

2.2 ATV 对QBC939 细胞Matrigel 体外侵袭力的影响 对照组QBC939 细胞过膜较多，体外侵袭能力强;药物干预组随着药物浓度的提高，QBC939 细胞过膜逐渐减少，各浓度组间比较，差异有统计学意义(P ＜0.05)。结果表明，ATV 可抑制QBC939 细胞对体外模拟的基底膜的侵袭力，其抑制作用呈剂量效应关系(见图2 ～3)。2.3 半定量RT-PCR 分析RhoC mRNA 的表达 经10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L ATV 干预组后细胞RhoC mRNA 的表达与对照组比较，差异无统计学意义(P ＞0.05，见表1)。

图1 不同浓度ATV 对QBC939 细胞增殖抑制作用Fig 1 Inhibitory effects of proliferation of different concentrations ATV on QBC939 cells

图2 不同浓度ATV 作用48 h 后QBC939 细胞过膜情况 A:对照组;B:10 μmol/L 浓度组;C:25 μmol/L 浓度组;D:50 μmol/L浓度组Fig 2 The membrane filtration of different con-cerntrations ATV on QBC939 cells after 48 hours A:control group;B:10 μmol/L concentration group;C:25 μmol/L concentration group;D:50 μmol/L concentration group

3 讨论

目前肿瘤的治疗以现代分子生物学、细胞生物学和分子免疫学等前沿科学为基础，强调肿瘤发生、发展和转归的分子基础和治疗的针对性、有效性。因而寻找一种既能抗肿瘤细胞增殖，又能降低肿瘤细胞远处侵袭能力的抗肿瘤药物，已成为近年来的研究热点。

他汀类药物是80 年代后期开发的一种新型调节血脂药物，通过抑制羟甲基戊二酸单酰辅酶A (HMGCoA)还原酶作用，减少甲羟戊酸(Mevalonic acid，MVA)合成及其下游产物，从而影响细胞许多重要的生物学功能:细胞膜构成、糖蛋白合成、细胞内信号转导及细胞周期进展等［2］。因此，他汀类药物作用的多效性除降血脂作用外，还包括逆转内皮功能异常、抗氧化剂活性、免疫调节、减少室性心律失常及血桩形成等作用［1］。近年来的体外研究还发现，他汀类药物对多种肿瘤细胞有抑制增殖，诱导分化或凋亡，抑制血管发生，降低侵袭、转移能力及增强放化疗等作用，是一种潜在的抗肿瘤药物［1］;两个大型的临床研究也证实了在正常人和黑色素瘤患者中，他汀类药物具有预防及抗肿瘤作用［3-4］。

图3 不同浓度ATV 对QBC939 细胞侵袭力的影响Fig 3 Effects of invasion in different concentrations ATV on QBC939 cell

Tab 1 Expression of RhoC mRNA after intervented with different concentrations of ATV intervention (x±s)

表1 不同浓度ATV 干预后RhoC mRNA 的表达情况(x±s)

Boyden 小室侵袭实验是体外检测肿瘤细胞侵袭力的经典方法。本实验通过Matrigel 侵袭实验，发现对照组QBC939 细胞透膜较多，体外运动能力较强;而经ATV 处理过的人胆管癌QBC939 细胞，其穿透Matrigel 胶的细胞数目明显减少，且随着ATV 浓度的提高透膜细胞数目逐渐减少，呈剂量效应关系。ATV 药物干预组与对照组比较，差异有统计学意义(P ＜0.05);各浓度组间比较，差异有统计学意义(P ＜0.05)。本研究显示，ATV 可以抑制肿瘤细胞的侵袭能力及运动能力。

他汀类药物可以抑制RhoC 的GGPP 活化修饰，导致胞浆中RhoC 的非活性(GDP 结合)形式富集而降低膜上RhoC 与GTP 的结合能力有关，最终导致RhoC 活性降低;从而影响细胞信号传导，降低其侵袭、转移能力［5］。结合本次的实验结果，我们推测:ATV 可能主要通过抑制肿瘤细胞Rho 蛋白的异戊烯化，即抑制Rho 的膜定位及其活性，从而影响细胞信号传导，包括p27KIP1 蛋白的降解、RhoC 的GGPP 活化修饰及其对MMP-9 的调控，进一步影响到细胞的生长、增殖及侵袭转移等过程。在后续的实验中我们将进一步探讨ATV 对RhoC 蛋白的异戊烯化的影响。

因此，我们认为，ATV 可抑制细胞体外侵袭及运动能力，这可能为胆管癌的治疗提供新的治疗方法。

［1］ Calabro P，Yeh ET. The pleiotropic effects of statins［J］. Curr Opin Cardiol，2005，20(6):541-546.

［2］ Goldstein JL，Brown MS. Regulation of the mevalonate pathway［J］.Nature，1990，343(1):425-430.

［3］ Graaf MR，Richel DJ，van Noorden CJ，et al. Effects of statins and farnesyltransferase inhibitors on the development and progression of cancer［J］. Cancer Treat Rev，2004，30(7):609-641.

［4］ Mo H，Elson CE. Studies of the isoprenoid-mediated inhibition of mevalonate synthesis applied to cancer chemotherapy and chemoprevention［J］.Exp Biol Med，2004，229(7):567-585.

［5］ Collisson EA，Kleer C，Wu M. et al. Atorvastatin prevents RhoC isoprenylation，invasion，and metastasis in human melanoma cells［J］.Mol Cancer Ther，2003，2(10):941-948.