青黛对结肠黏膜成纤维细胞的影响及作用机制

陈小璇，代剑平，朱丹霞，王革非，李康生

汕头大学医学院微生物与免疫学教研室，广东 汕头515041

青黛是由菘蓝(Isatis Indigotica)、板蓝根(baphicacanthus cusia Bremek)和马蓝(strobilanthes formosanus moore)等植物加工而成的深蓝色粉末;咸，寒，归肝经;清热解毒、凉血定惊;含靛玉红、靛蓝、色胺酮和青黛酮等。现代研究显示青黛具有清热抗炎、抗菌抗病毒和抗肿瘤等活性;可清除羟自由基，抑制ROS 产生;抑制人中性粒细胞ERK/p38/JNK MAPK 信号通路［1-2］。临床青黛还常用于多种溃疡，如溃疡性结肠炎、糖尿病慢性下肢溃疡、口腔溃疡和消化性溃疡。“青黛灌肠”现已成为临床治疗溃疡性结肠炎常用方法［3］。溃疡愈合是一个复杂的生物学过程。成纤维细胞老化衰退、胞外基质沉积障碍、慢性炎症反应、细胞生长因子缺失、感染、缺血或神经病变等都可导致慢性溃疡［4］。其中，成纤维细胞增殖能力过低和适宜的细胞外基质的缺失是慢性溃疡常见的发病机制［5］。任何干扰成纤维细胞正常功能的刺激都会防碍伤口正常愈合，导致慢性难愈性溃疡［6］。目前青黛的药理研究多集中在抗炎方面，关于青黛对成纤维细胞的直接影响没有任何报道。本研究拟探讨青黛对小鼠结肠黏膜成纤维细胞增殖和胶原积累的影响及其潜在机制。

1 材料和方法

1.1 材料 青黛购自镇江存仁堂有限责任公司(镇江，中国)，经韩邦兴博士(江苏大学，中国)鉴定，高效液相色谱(JASCO，日本)检测显示其靛玉红、靛蓝和色胺酮含量分别为0. 589 mg/g、0. 512 mg/g 和0. 065 mg/g 原生药。青黛提取物制备:称100 g 青黛，加700 ml 双蒸水，100 ℃，3 次，2 h/次，收集上清，命名为水提物;沉积物继续加700 ml 95%乙醇，70 ℃，3 次，2 h/次，收集上清，命名为醇提物(非水溶性成分)。另取青黛100 g，先700 ml 双蒸水，100 ℃，3 次，2 h/次，然后700 ml 95%乙醇，70 ℃，3 次，2 h/次，最后混合上清，命名为总提物。真空干燥，待用。

1.2 细胞培养和MTT 实验 Balb/c 小鼠50 只，平均体质量(20 ±2)g，雌雄各半。正常饲养1 周，颈椎脱臼处死，无菌剥取结肠黏膜，小鼠结肠黏膜成纤维细胞培养方法参照之前文献［7］。实验方案经汕头大学医学院实验动物中心审批。人永生化表皮细胞(HaCaT)用含10%胎牛血清(FCS)的1640 培养液培养。青黛水提物、醇提物和总提物对小鼠黏膜成纤维细胞和HaCaT 细胞生长的影响用MTT 法测定［7］。青黛水提物、醇提物和总提物系列浓度(12. 5、25、50、100、200 μg/ml)用1% FCS DMEM 培养液配制，DMSO≤0.5%。药物处理48 h，空白对照为1% FCS DMEM培养液(DMSO=0.5%)。

1.3 质粒构建、转染和双荧光素酶分析 构建人胶原蛋白基因α1(Ⅰ)和α1(Ⅲ)启动子荧光素酶报告质粒，人胶原基因α1(Ⅰ)(COL1A1，NW_004078092.1)和α1(Ⅲ)(COL3A1，NW_004078008.1)启动子序列分别插入pGL3-Basic，并命名为pCol1A1-p-Luc 和pCol3A1-p-Luc。克隆COL1A1 启动子引物为F:5＇-AAAGGTACCACATATGGGGAGGGGCGGGGAGC-3＇，R:5＇-AGGCTCGAGCCTCTTGGCCGTGCGTCA GGA-3＇(2 042 bp);克隆COL3A1 启动子引物为F:5＇-GGGGGTACCTGCATATAACAGCCTTTCCCCAG-3＇，5＇-AAACTCGA GAGTGGGATGAAGCAGAGCGAG-3＇(2 068 bp)。人HaCaT 细胞(1 ×104/孔)接种96 孔板，Lipofectamine 2000 转染，pRL-CMV 质粒为内参。37 ℃，6 h，PBS 洗3 次，然后分别加12.5 μg/ml 水提取物、25 μg/ml 醇提取物、25 μg/ml 和50 μg/ml 总提取物。24 h，收集细胞，双荧光素酶报告基因检测试剂盒(BD Biosciences Clontech，美国)测定荧光素酶活性。

1.4 羟脯氨酸测定 小鼠结肠黏膜成纤维细胞(1 ×105/孔)接种24 孔板，24 h，再加含12.5 μg/ml 水提取物、25 μg/ml 醇提取物、25 μg/ml 和50 μg/ml 总提取物的1%FCS DMEM 培养液，48 h，收集上清，氯胺T 法测羟脯氨酸含量［7］。胶原蛋白量用μg/106个细胞表示，假定胶原蛋白含13. 5% 羟脯氨酸。另，为确定PKC 和ERK MAPK 信号通路是否对青黛总提物诱导胶原蛋白产生有重要作用，我们用青黛总提物(25 μg/ml 和50 μg/ml)处理细胞，同时加入浓度为10 μmol/L PKC 抑制剂(Calphostin C)和ERK 抑制剂(U1026)，最后测定胶原蛋白水平。

1.5 明胶酶谱分析 小鼠黏膜成纤维细胞处理同羟脯氨酸测定。收集上清，用于明胶酶谱分析和ELISA测定;收集细胞用于qRT-PCR 和Western blotting 分析。MMP-2/-9 活性用Bandscan 软件进行灰度扫描并用面积×平均灰度值表示［7］。

1.6 实时定量PCR (qRT-PCR) 小鼠黏膜成纤维细胞处理同羟脯氨酸测定。Trizol 提取总RNA，核酸酶DNase I 处理，反转录并做实时定量PCR。试剂盒购自Invitrogen 并按说明书进行。引物设计用Primer Express 3.0 软件(见表1)。结果表示为2-ΔΔCt。

表1 引物序列表Tab 1 The sequences of primers

1.7 酶联免疫吸附反应(ELISA) 小鼠黏膜成纤维细胞处理同羟脯氨酸测定。ELISA 试剂盒(北京达科为生物技术有限公司)测定上清液TIMP-1、TIMP-2、CTGF、TGFβ1、IL-6、TNF-α 和IL-1 水平，结果用pg/ml表示。

1.8 蛋白质印迹(Western blotting) 小鼠黏膜成纤维细胞处理同羟脯氨酸测定。抗Akt、p-Akt、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、p-PKC(pan)和PKC(pan)抗体以及辣根过氧化物酶标记的抗兔或抗山羊二抗均购自CST 公司(美国)。蛋白质浓度测定用BCA 蛋白测定试剂盒(碧云天，中国)，20 mg 蛋白质上样进行SDS-PAGE 电泳［8］。

1.9 统计学处理 数据用SPSS 13.0 单因素方差分析(ANOVA)进行统计，结果表示为平均值±标准差，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 青黛提取物对小鼠黏膜成纤维细胞增殖和胶原积累的影响 MTT 实验显示:青黛水提物能剂量依赖性地促进小鼠黏膜成纤维细胞增殖，醇提物则剂量依赖性地抑制小鼠黏膜成纤维细胞增殖，总提物在低浓度(25 μg/ml ～50 μg/ml)时能显著促进小鼠黏膜成纤维细胞增殖。青黛水提物和总提物最小有效浓度分别为12.5 μg/ml 和25 μg/ml，醇提物最大无细胞毒性浓度为25 μg/ml(见图1A)。羟脯氨酸实验:青黛水提物可促进胶原积累;醇提物可降低胶原积累，但处理组与空白组(1% FCS)相比无显著性差异;青黛总提物在12.5 ～50 μg/ml 浓度下可显著促进胶原积聚(见图1B)。另外，荧光素酶报告质粒实验:水提物(12.5 μg/ml)和总提物(25 μg/ml 和50 μg/ml)均能显著提高荧光素酶活性，说明两者均能激活胶原基因COL1A1 和COL3A1 启动子转录，但青黛醇提物无此活性(见图2A ～B)。qRT-PCR 试验显示相似的结果(见图2C)。

图1 青黛提取物对小鼠黏膜成纤维细胞增殖和胶原积累的影响 A:MTT 法测定青黛对小鼠黏膜成纤维细胞增殖的影响;B:氯胺T 法测定青黛提取物对MCF 细胞胶原积累的影响;图2 青黛提取物对胶原基因COL1A1 和COL3A1 转录的影响 A ～B:pCol1A1-p-Luc 和pCol3A1-p-Luc 双酶切结果和荧光素酶报道质粒测定结果;C:qRT-PCR 试验结果Fig 1 Effects of indigo naturalis extracts on the proliferation and collagen accumulation of mice colonicfibrolasts A:effects of indigo naturalis extracts on the proliferation determined by MTT method;B:effects of indigo naturalis extracts on collagen accumulation determined by chloramine T method;Fig 2 Effects of indigo naturalis extracts on the transcription of procollagen genes COL1A1 and COL3A1 A ～B:double enzyme digestion of plasmids and the result of the luciferase reporter plasmid assay;C:result of qRT-PCR assay

2.2 青黛提取物对MMPs 和TIMPs 活性及生成的影响 明胶酶谱试验显示:与空白组相比，水提物(12.5 μg/ml)和总提物(50 μg/ml)可显著提高MMP-2/-9 活性，总提物在25 μg/ml 时还可显著提高MMP-2活性;相反醇提物(25 μg/ml)却显著抑制MMP-2 活性(见图3A ～C)。qRT-PCR 结果显示:水提物(12. 5 μg/ml)和总提物(50 μg/ml)能显著提高MMP-1/-13转录，醇提物(25 μg/ml)抑制效果不显著(见图3D)。此外，qRT-PCR 和ELISA 检测TIMP-1/-2 发现:青黛水提物(12.5 μg/ml)及总提物(25 μg/ml 和50 μg/ml)均能显著促进TIMP-1/-2 产生，醇提物(25 μg/ml)对此无显著效应(见图3D ～F)。

2.3 青黛提取物对细胞因子转录及释放的影响TGFβ1、CTGF、IL-6、IL-1 和TNF-α 在伤口愈合中发挥重要作用［9］。qRT-PCR 和ELISA 试验显示:水提物(12.5 μg/ml)能显著促进TGF-β1 和CTGF 转录和释放;醇提物(25 μg/ml)可显著抑制TGF-β1、CTGF、IL-6、IL-1 和TNF-α 转录和释放;总提取物在25 μg/ml 和50 μg/ml 浓度时可显著抑制IL-6、IL-1 和TNF-α 转录和释放，但在50 μg/ml 浓度时能显著促进CTGF 转录和释放(见图4)。

2. 4 青黛提取物对AKT、PKC 和ERK/JNK/p38MAPK 信号通道的影响 Western blotting 试验显示:青黛水提物(12. 5 μg/ml)可显著提高p-Akt、p-PKC(pan)、p-ERK、p-JNK 和p-p38 磷酸化水平;醇提物(25 μg/ml)可显著抑制Akt 和p38 MAPK 信号通路活化;总提取物(25 μg/ml 和50 μg/ml)可显著抑制Akt 信号通路活化，但显著激活PKC 和ERK MAPK 信号通路(见图5)。PKC 抑制剂(Calphostin C)和ERK抑制剂(U1026)都可显著拮抗青黛总提物诱导的胶原蛋白产生，这表明PKC 和ERK MAPK 信号通路在青黛总提物诱导胶原蛋白生成时起重要作用(见图6)。

图3 青黛提取物对MMPs 和TIMPs 活性及表达的影响 A ～C:明胶酶谱试验，1:1% FCS+水提物(12.5μg/ml);2:1% FCS+醇提物(25 μg/ml);3:1% FCS+总提物(50 μg/ml);4:1% FCS+总提物(25 μg/ml);5(空白):1% FCS;6(阳性):10% FCS;D:qRT-PCR 试验结果;E ～F:ELISA 试验结果。Fig 3 Effects of indigo naturalis extracts on the activity and production of MMPs and TIMPs A ～C:Gelatin zymography assay;D:qRT-PCR assay;E ～F:ELISA assay

3 讨论

青黛常用于治疗多种溃疡，现临床溃疡性结肠炎患者常口服青黛粉或青黛灌肠［3］。此外，青黛还可用于治疗顽固性牛皮癣［10］，该病重要特征是基底层角朊细胞过度增生。从临床应用来看，青黛的药理机制似乎有自相矛盾之处，即治疗溃疡时促进细胞增生创面愈合，在治疗牛皮癣时抑制细胞增生。本研究结果发现，青黛含两种对小鼠黏膜成纤维细胞增殖和胶原积累作用相反的成分，青黛水提物可促进小鼠黏膜成纤维细胞增殖和胶原积累，增强MMPs 和TIMP-1/-2 活性和产生，提高CTGF 和TGFβ1 水平，以及激活PI3K/Akt、PKC 和ERK/JNK/p38 MAPK 信号通道，所有这些有利于溃疡愈合，但青黛醇提物(非水溶性成分)几乎起相反作用，不仅抑制MCF 细胞增殖，抑制TGFβ1 和CTGF 转录和释放，还抑制PI3K/Akt 和p38 MAPK 信号通路。为探讨临床口服青黛粉或青黛灌肠治疗溃疡性结肠炎的机制，我们首先用水充分提取青黛，再用95%乙醇提取，最后混合，获得总提取物。实验结果发现，总提物在低浓度(25 ～50 μg/ml)下能促进MCF 细胞增殖和胶原积累，提高MMPs 和TIMP-1/-2 的活性及产生，提高CTGF 和TGFβ1 水平，并激活PKC 和ERK MAPK 信号通道，所有这些都有利于溃疡愈合。因此，我们建议:在治疗溃疡时，总提取物是最佳的选择，因为它含有丰富的水提物成分;在治疗顽固性牛皮癣时，最好使用青黛醇提物。事实上，临床已经用青黛油治疗顽固性牛皮癣，用以水溶性物质为基质的青黛灌肠剂来治疗溃疡性结肠炎［3，10］。

图4 青黛提取物对细胞因子转录及释放的影响 A:qRTPCR 试验结果;B:ELISA 试验结果Fig 4 Effects of indigo naturalis extracts on the transcription and release of cytokines A:qRT-PCR assay;B:ELISA assay

图5 青黛提取物对AKT、PKC 和ERK/JNK/p38 MAPK 信号通道的影响Fig 5 Effects of indigo naturalis extracts on the activation of AKT，PKC and ERK/JNK/p38 MAPK signal pathways

图6 PKC 抑制剂和ERK 对青黛总提物诱导胶原蛋白的影响Fig 6 Effects of PKC and ERK inhibitors on the indigo naturalis total extract-induced production of collagen

虽然过多的MMPs 可能有碍溃疡愈合，但分泌型MMPs 能重塑基底膜，促细胞迁移，促表皮再生［11］。基因敲除鼠MMP-3-/-、MMP-8-/-、MMP-9-/-和MMP-13-/-表现出显著的伤口愈合延迟，MMP-3-/-伤口收缩力缺失，MMP-9-/-和MMP-13-/-细胞迁移速度显著减缓［11］。MMPs 外源性抑制剂显著延长伤口愈合［12］。在本试验中，青黛水提物和总提物都可提高MMPs 活性和生成，这可能有助于基底膜重塑、细胞迁移和表皮再生，有利于溃疡愈合。

据报道，PI3K/Akt 和ERK/JNK/p38 MAPK 信号通路在溃疡愈合中起重要作用［13］。PKC 通路是细胞增殖和胶原合成所必需的，PKC-ε 活化可激活MEK/ERK，增强胶原表达［14］。IL-1β 活化PKC 和ERK/JNKs 途径，促进MMP-2/-9 表达［9］。本研究显示，青黛总提物可显著激活PKC 和ERK 信号通路，且PKC抑制剂(Calphostin C)和ERK 抑制剂(U1026)可显著拮抗青黛总提物诱导胶原蛋白产生，由此推测，PKC和ERK 信号通路在青黛总提物促溃疡愈合中发挥重要作用。

总之，青黛含有两种对小鼠黏膜成纤维细胞功能影响相反的成分，青黛总提物可促进结肠黏膜成纤维细胞增殖及胶原积累，提高MMPs 和TIMP-1/-2 的活性及产生，上调TGFβ1 和CTGF 水平，其促进溃疡治愈的机制可能依赖于PKC/ERK MAPK 信号通路。

［1］ Chang HN，Pang JH，Yang SH，et al. Inhibitory effect of indigo naturalis on tumor necrosis factor-alpha-induced vascular cell adhesion molecule-1 expression in human umbilical vein endothelial cells［J］. Molecules，2010，15(9):6423-6435.

［2］ Lin YK，Chen HW，Leu YL，et al. Indigo naturalis upregulates claudin-1 expression in human keratinocytes and psoriatic lesions［J］. J Ethnopharmacol，2013，145(2):614-620.

［3］ Suzuki H，Kaneko T，Mizokami Y，et al. Therapeutic efficacy of the Qing Dai in patients with intractable ulcerative colitis［J］. World J Gastroenterol，2013，19(17):2718-2722.

［4］ Usui ML，Mansbridge JN，Carter WG，et al. Keratinocyte migration，proliferation，and differentiation in chronic ulcers from patients with diabetes and normal wounds ［J］. J Histochem Cytochem，2008，56(7):687-696

［5］ Hehenberger K，Heilborn JD，Brismar K，et al. Inhibited proliferation of fibroblasts derived from chronic diabetic wounds and normal dermal fibroblasts treated with high glucose is associated with increased formation of l-lactate［J］. Wound Repair Regen，1998，6(2):135-141.

［6］ Lerman OZ，Galiano RD，Armour M，et al. Cellular dysfunction in the diabetic fibroblast:impairment in migration，vascular endothelial growth factor production，and response to hypoxia［J］. Am J Pathol，2003，162(1):303-312.

［7］ Dai JP，Chen J，Bei YF，et al. Influence of borneol on primary mice oral fibroblasts:a penetration enhancer may be used in oral submucous fibrosis［J］. J Oral Pathol Med，2009，38(3):276-281.

［8］ Dai JP，Zhao XF，Zeng J，et al. Drug screening for autophagy inhibitors based on the dissociation of beclin1-Bcl2 complex using BiFC technique and mechanism of eugenol on anti-influenza a virus activity［J］.PLoS One，2013，8(4):e61026.

［9］ Xie Z，Singh M，Singh K. Differential regulation of matrix metalloproteinase-2 and -9 expression and activity in adult rat cardiac fibroblasts in response to interleukin-1beta［J］. J Biol Chem，2004，279(38):39513-39519.

［10］ Lin YK. Indigo naturalis oil extract drops in the treatment of moderate to severe nail psoriasis:a small case series ［J］. Arch Dermatol，2011，147(5):627-629.

［11］ Kyriakides TR，Wulsin D，Skokos EA，et al. Mice that lack matrix metalloproteinase-9 display delayed wound healing associated with delayed reepithelization and disordered collagen fibrillogenesis［J］. Matrix Biol，2009，28(2):65-73.

［12］ Mirastschijski U，Schnabel R，Claes J，et al. Matrix metalloproteinase inhibition delays wound healing and blocks the latent transforming growth factor-beta1-promoted myofibroblast formation and function［J］. Wound Repair Regen，2010，18(2):223-234.

［13］ Tsubaki M，Yamazoe Y，Yanae M，et al. Blockade of the Ras/MEK/ERK and Ras/PI3K/Akt pathways by statins reduces the expression of bFGF，HGF，and TGF-beta as angiogenic factors in mouse osteosarcoma［J］. Cytokine，2011，54(1):100-107.

［14］ Tourkina E，Gooz P，Pannu J，et al. Opposing effects of protein kinase Calpha and protein kinase Cepsilon on collagen expression by human lung fibroblasts are mediated via MEK/ERK and caveolin-1 signaling［J］. J Biol Chem，2005，280(14):13879-13887.