aFGF、HGF 体外诱导小鼠ESC 向肝细胞定向分化及标志物研究

应佳丽，王雪玲，范丽娇，张少艳

台州学院医学院护理系，浙江 台州318000

胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)可发育成完整个体，具有分化为各种细胞的潜能，理论上ESC 可无限增殖并进行全能分化。ESC 可在体外培养发育成拟胚体(embryonic body，EB)，拟胚体具有外、中、内胚层，三胚层结构之间分泌细胞因子相互作用，进而向各组织类型细胞分化。中胚层心肌细胞产生成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)，诱导内胚层细胞发育，并由同步分化的内皮细胞支持肝细胞发育形成肝样组织［1］。利用三胚层结构分化成肝细胞，模拟体内肝脏的发育过程，分化所得肝细胞具有体内正常肝细胞的特征和功能［2］，小鼠体内实验表明，ESC 分化所得肝细胞前体细胞可使小鼠肝脏再生［3］。因此，ESC 体外分化衍生的肝组织在肝脏发育研究、药物代谢、肝脏衰竭细胞治疗和组织工程应用研究中具有重要意义。也可以为开展肝组织工程、肝细胞移植等研究提供有效的组织细胞来源，由此可见，体外诱导ESC 分化成肝细胞的研究具有重要的基础研究及临床应用价值［2］。本研究利用酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor，aFGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)对小鼠ESC 体外定向诱导，使其定向分化成肝细胞，检测培养上清液中甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)、白蛋白(albumin，ALB)浓度以及细胞角蛋白8(cytokeratin，CK8)、细胞角蛋白18(CK18)在细胞内mRNA 和蛋白表达水平。为ESC 体外的定向诱导建立合理的诱导体系，提高肝细胞分化率，同时也为体外生产肝细胞用于肝细胞移植奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 ESC 由中山大学实验动物中心建系，并保存为Balb/c 系小鼠ESC。细胞培养试剂:ESC 培养基:DMEM (美国Gibico 公司)，胎牛血清(杭州四季清公司)，巯基乙醇(美国Gibico 公司)，HEPES、青霉素和链霉素(美国Gibco-BRL 公司)，重组小鼠白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)(美国Gibico-l Bra公司)。EB 培养基:除LIF 外，其余成分同ESC 培养基，白明胶(美国Sigma 公司)。细胞生长因子:aFGF、HGF(美国Sigma 公司)。CK8、CK18 一抗(丹麦DAKO 公司)，抗小鼠ALB 一抗(美国Biodesign 公司)。放射免疫法(RIA)试剂盒(北京中国原子能研究院)。

1.2 研究方法

1.2. 1 ESC 培养:将保存在液氮中的Balb/c 小鼠ESC 取出，立即置于37 ℃解冻复温，离心弃上清后加入ESC 培养基吹散，以2 ×104个/ml 的密度将细胞转至一次性塑料培养瓶中。每天换液1 次，每2 ～3 d 传代1 次。

1.2.2 ESC 发育成为EB:换用EB 培养基，将细胞转至玻璃培养瓶中用摇动培养法培养，每1 h 摇动细胞1 次，使其悬浮生长发育成为EB，第2 天开始2 ～3 h摇动1 次。期间每1 ～2 d 换液1 次，培养5 d。

1.2.3 肝细胞定向诱导分化:EB 培养5 d 后，转至0.1%白明胶处理过的24 孔板上，使其充分贴壁生长，胚体贴壁并向四周分化出多种形态的细胞;第7 ～11 天，加入aFGF，浓度分别为20、40、60、80 ng/ml;第11 ～15 天，加入HGF，浓度分别为10、20、30、40 ng/ml。设立对照组，不加aFGF、HGF，使其自然分化。1.2.4 上清中AFP 和ALB 测定:EB 加入不同浓度aFGF 继续培养5 d 后，收集诱导组和对照组培养上清液2 ml，EB 加入HGF 继续诱导，5 d 后，再次收集培养上清液，RIA 法测定AFP、ALB 浓度。

1.2.5 ALB、CK8、CK18 的mRNA 和蛋白表达水平:EB 先后经aFGF、HGF 诱导后，收集细胞，对分化细胞进行PCR 和Western blotting 检测，观察肝细胞标志物ALB、CK8、CK18 在细胞内表达水平。

(1)RT-PCR:离心收集细胞，Trizol 裂解法提取细胞RNA，进行RT-PCR。逆转录体系总体积为25 μl:取RNA 2 μg，DEPC 水补足至16 μl，10 μmol/L Oligo-(dT)18 1 μl，5 ×RT buffer 5 μl，dNTP 1.5 μl，Rnase Inhibitor 0.5 μl，M-MLV 1 μl，4 ℃离心混匀，37 ℃反应1 h，95 ℃10 min 终止反应。所得cDNA 置于20 ℃保存。

(2)PCR:取cDNA 2 μl，加入灭菌水15 μl，10 ×buffer 2.5 μl，MgCl2，dNTP 1 μl，引物2 μl(上海生工公司合成，引物序列见表1)。Taq DNA 聚合酶0.5 μl，混匀，离心，放入PCR 仪器扩增。PCR 反应条件为:首先94 ℃变性5 min;然后进入循环条件:94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循环周期为30个，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃暂存。取9 μl PCR 产物，与1 μl 10 × loading buffer 混匀，于2%琼脂糖凝胶，1 ×TBE 缓冲液中电泳。电泳条带经Gel Doc EQ图像分析仪拍照，并用ipp6.0 分析电泳条带灰度值。

表1 PCR 扩增引物序列Tab 1 The sequence of primers

(3)Western blotting:收集细胞，提取蛋白后测定蛋白浓度，经SDS-PAGE 电泳后转膜，转膜后置入5%脱脂奶粉中，37 ℃封闭1 h，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃过夜，清洗后加入二抗孵育(1∶300)，37 ℃孵育1 h，清洗后滴加ECL 工作液使其将膜完全覆盖，与膜共孵育5 min，吸干表面水分后曝光，曝光胶片经扫描为图片后经ipp6.0 分析。

1.3 统计学处理 所得数据经SPSS 19.0 统计学软件处理。实验数据用平均值表示。组间比较采用t 检验，方差分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义，P ＜0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 上清液中AFP 和ALB 水平测定 不同浓度aFGF 诱导5 d 后，测定上清液中AFP 和ALB 浓度。上清液中AFP 浓度降低，aFGF 浓度为40 ng/ml 时，与对照组相比，差异有统计学意义(P ＜0.05)，aFGF 浓度为60 ng/m 和80 ng/ml 时，与对照组相比，差异有显著统计学意义(P ＜0.01)，呈浓度依赖性。ALB 浓度升高，aFGF 浓度为60 ng/m 和80 ng/ml，与对照组比较，差异有统计学意义(P ＜0.05，见图1)。5 d 后加入不同浓度HGF 继续诱导，上清液中AFP 浓度降低，20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml 时与对照组相比，差异有统计学意义(P ＜0.05)，ALB 浓度升高，浓度为20 ng/

图1 aFGF 诱导ESC 后上清液中AFP 和ALB 水平Fig 1 The concentration of AFP and ALB in the supernatants after the induction of ESC with aFGF

图2 HGF 诱导ESC 后上清液中AFP 和ALB 水平Fig 2 The concentration of AFP and ALB in the supernatants after the induction of ESC with HGF

ml 时与对照组相比，差异有统计学意义(P ＜0.05);浓度为30 ng/ml、40 ng/ml，与对照组相比，差异有显著统计学意义(P ＜0.01)，呈浓度依赖性(见图2)。2.2 ALB、CK8、CK18 的mRNA 表达水平 PCR 结果经ipp6.0 分析，mRNA 表达水平用实验组和对照组比值表示。加入不同浓度aFGF 继续培养5 d 后，细胞中ALB、CK8、CK18 的mRNA 表达水平升高，与对照组相比，差异有统计学意义(P ＜0.05)，呈浓度依赖性(见图3A)。浓度为60 ng/ml 的aFGF 诱导5 d 后加入不同浓度HGF 继续诱导，细胞中ALB、CK8、CK18的mRNA 表达水平升高，与对照组相比，差异有统计学意义(P ＜0.05)，呈浓度依赖性(见图3B)。

图3 诱导后ESC 细胞中ALB、CK8、CK18 的mRNA 表达水平 A:不同浓度aFGF 诱导5 d 后细胞中ALB、CK8、CK18 的mRNA表达水平;B:浓度为60 ng/ml 的aFGF 诱导5 d 后加入不同浓度HGF，继续培养5 d 后细胞中ALB、CK8、CK18 的mRNA 表达水平Fig 3 The mRNA expression of ALB，CK8 and CK18 in ESC after induction A:The mRNA expression of ALB，CK8 and CK18 in ESC after induction with aFGF for 5 days. B:After distribution with aFGF (60 ng/ml)for 5 days，ESC was induced with different concentration of HGF for another 5 days. The mRNA expression of ALB，CK8 and CK18 in ESC was detected after induction

2.3 ALB、CK8、CK18 的蛋白表达水平 Western blotting 测定结果经ipp6.0 分析，加入不同浓度aFGF 后继续培养5 d 后，细胞中ALB、CK8、CK18 的蛋白表达水平升高，与对照组相比，差异有统计学意义(P ＜0.05，见图4A)。浓度为60 ng/ml 的aFGF 诱导5 d 后加入不同浓度HGF 继续诱导，细胞中ALB、CK8 的蛋白表达水平升高，与对照组相比，差异有统计学意义(P ＜0.05，见图4B)，CK18 的蛋白表达水平和对照组相比，差异有显著统计学意义(P ＜0.01)，呈浓度依赖性。

图4 诱导后ESC 细胞中ALB、CK8、CK18 的蛋白表达水平 A:不同浓度aFGF 诱导5 d 后细胞中ALB、CK8、CK18 的蛋白表达水平;B:浓度为60ng/ml 的aFGF 诱导5 d 后加入不同浓度HGF，继续培养5 d 后细胞中ALB、CK8、CK18 的蛋白表达水平Fig 4 The protein expression of ALB，CK8 and CK18 in ESC after induction A:The protein expression of ALB，CK8 and CK18 in ESC after induction with aFGF for 5 days. B:After distribution with aFGF (60 ng/ml)for 5 days，ESC was induced with different concentration of HGF for another 5 days. The protein expression of ALB，CK8 and CK18 in ESC was detected after induction

3 讨论

ESC 体外发育过程很难模拟。已有研究表明通过EB 实现ESC 向肝细胞的分化，细胞之间的相互作用可启动肝细胞的早期分化［4］，但分化得到的细胞种类较多，分化率较低，因此有必要进行更有效的定向诱导分化。此外，也可通过成体干细胞诱导生成肝细胞［5］，已有研究证实，体外诱导骨髓间充质干细胞等诱导可生成肝细胞［5-6］，两种方法在取材和肝细胞分化率中各有优缺点，都具有重要研究价值。

在胚胎发育过程中，FGF 由中胚层细胞分泌，参与诱导内胚层细胞向肝细胞方向分化，对于早期ESC 分化为肝细胞具有重要作用［7］。本实验通过EB 培养后加入aFGF 和HGF 诱导ESC 向肝细胞方向分化。EB培养5 d 后依次加入不同浓度aFGF、HGF，继续培养后，细胞上清液中AFP 浓度降低，ALB 浓度升高，细胞中ALB、CK8、CK18 的mRNA 和蛋白表达水平升高，相比较而言，CK8、CK18 的mRNA 和蛋白表达水平在aFGF 诱导后升高更为显著;而ALB 在HGF 诱导后升高更显著。AFP 为早期肝细胞标志，肝细胞成熟过程中表达量逐渐降低，ALB 及CK18 为成熟肝细胞标志物［8］。结果提示，aFGF 更多参与早期肝细胞诱导分化过程，HGF 对于后期肝细胞诱导分化具有重要作用。已有研究发现，FGF4 可促进小鼠ESC 向肝细胞方向分化［9］，肝细胞分化标志AFP、HNF4 表达升高，ALB、HNF1 表达未出现明显变化。本研究表明，aFGF 诱导后细胞中AFP 表达降低，ALB、CK8、CK18 表达升高。不同细胞因子诱导ESC 分化后肝细胞标志物表达不同，提示其诱导作用机制存在差异，也有可能因诱导时间不同，肝细胞处于不同分化阶段，进而表达的肝细胞标志物有所不同。

ESC 诱导向肝细胞方向分化是近年来研究热点［10］，如何优化诱导体系的相关研究众多［11］。本实验从模拟体内ESC 发育为基础，利用ESC 发育成肝细胞所需细胞因子进行诱导，避免使用DMSO 等外源因素［8］，防止对细胞造成可能的毒性作用［12］，更有利于进一步研究及临床应用。ESC 向肝细胞方向分化是一个复杂而缜密的过程［13］，aFGF 和HGF 的诱导作用机制尚不明确，其涉及的信号通路有待进一步研究。

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