西兰花种子中萝卜硫素的提取工艺研究

（微生物药物国家工程研究中心，河北省工业微生物代谢工程技术研究中心，华北制药集团新药研究开发有限责任公司，河北石家庄050015）

十字花科蔬菜（如花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝及菠菜等）富含多种芥子苷（glucosinnolates），当其被咀嚼时，硫代葡萄糖苷（一种芥子苷）会被硫代葡萄糖苷酶水解，产生萝卜硫素（sulforaphane）。

萝卜硫素分子量为177.3，分子式为C6H11S2NO。萝卜硫素通过调控致癌物的代谢而起作用［1］，它能通过作用于人体内的“phase two enzymes”激发人体的自我抗癌机制，中和体内某些致癌化学物质，造成癌细胞阻滞，抑制其繁殖并诱导其死亡，可有效预防胰腺癌、肺癌、直肠癌、乳腺癌及前列腺癌等多种癌症的发生［2－4］。萝卜硫素是目前发现的蔬菜中抗癌效果最好、效力最强的天然活性物质，作为药品或食品的功效成分，具有很高的研究价值和广阔的市场前景。

作者在此以西兰花种子为原料，提取其中的萝卜硫素，并对提取工艺进行了优化。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

西兰花种子，杭州勿忘农种子公司。

去离子水，自制；无水硫酸钠，天津光复科技发展有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司；高速匀浆机，上海龙屹仪器仪表有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器，郑州长城科工贸有限公司；高效液相色谱仪（996检测器，515泵），Waters公司；Loborata 4000型旋转蒸发器，Heidolph 公司；中压层析系统（C－601泵，C－615控制器，C－616收集器，C－635检测器），瑞士Buchi公司。

1.2 方法

提取：将20g西兰花种子用粉碎机打碎，磨成粉末状后等量分成2份。一份加入预冻的正己烷，用高速匀浆机混合均匀后脱脂，过滤，加入100mL 去离子水；另一份不脱脂直接加入100mL去离子水。2份均用0.5mol·L－1盐酸溶液调pH 值至4.0，25 ℃恒温水浴下磁力搅拌12h，用2倍体积乙酸乙酯萃取3遍，加入过量无水硫酸钠置于冰库脱水4h，过滤，滤液在35 ℃减压浓缩，所得浸膏称重，计算萝卜硫素粗品的质量分数（提取率）。比较脱脂和未脱脂的西兰花种子中萝卜硫素的提取率。

分别考察水解pH 值、水解时间、萃取溶剂对脱脂西兰花种子中萝卜硫素提取率的影响，确定最优的提取工艺。

精制：将萝卜硫素粗品用丙酮溶解，进行硅胶柱层析。用乙酸乙酯进行洗脱，分管收集后进行检测，将纯度超过95%的洗脱液合并，真空浓缩至干，得萝卜硫素精制品。

色谱条件：Hypersil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，10μm）；流动相为甲醇－水（30∶70，体积比）；流速1.0mL·min－1；检测波长254nm；进样量10μL。

2 结果与讨论

2.1 脱脂对提取率的影响（图1）

图1 脱脂对提取率的影响Fig.1 Effect of degreasing on extraction rate

由图1可见，脱脂后的提取率远高于未脱脂的提取率。这是因为，未脱脂西兰花种子含有大量的油脂，阻碍了硫代葡萄糖苷与硫代葡萄糖苷酶的接触，无法使萝卜硫素完全释放；而且由于混合液中含有大量的水溶性蛋白和多糖，沉淀物质较多，溶液黏度很大，导致在萃取和过滤时一部分萝卜硫素无法被乙酸乙酯洗脱，提取率较低。

2.2 水解pH 值对提取率的影响（图2）

图2 水解pH 值对提取率的影响Fig.2 Effect of hydrolysis pH value on extraction rate

由图2可见，水解pH 值为5.0时，提取率最高。实验发现，脱脂西兰花种子水溶液用盐酸溶液调pH值至5.0后于室温水解12h的提取率最高；但高效液相色谱检测发现水解pH 值为5.0时的提取物中含有异硫氰酸盐杂质，而水解pH 值为4.0时的提取物相对纯度提高很大，且滤液中的蛋白质能够有效聚集沉淀，可通过反复萃取除去。因此，选择水解pH 值为4.0较为适宜。

2.3 水解时间对提取率的影响（图3）

图3 水解时间对提取率的影响Fig.3 Effect of hydrolysis time on extraction rate

由图3可知，提取率随着水解时间的延长先升高后降低，在水解时间为12h时，达到最高。这是因为，萝卜硫素由于外部环境的变化逐渐不稳定，在水解时间为12h时达到了生成与降解的平衡。因此，为了防止萝卜硫素降解，应及时终止水解反应并进行乙酸乙酯萃取，故选择水解时间为12h较为适宜。

2.4 萃取溶剂对提取率的影响（表1）

表1 萃取溶剂对提取率的影响Tab.1 Effect of extraction solvent on extraction rate

由表1可知：以二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮为萃取溶剂时，萝卜硫素的纯度变化不大，而提取率依次降低，其中以二氯甲烷为萃取溶剂时的提取率最高，且溶残率低；以正己烷为萃取溶剂时，不能有效提取萝卜硫素。考虑到二氯甲烷的毒性较大，选择乙酸乙酯作为萃取溶剂较为适宜。

2.5 萝卜硫素粗品的精制

萝卜硫素粗品呈油状，经丙酮溶解后装入硅胶柱，用乙酸乙酯分离提纯后，有效去除杂质，纯度由86%提高到95%以上，提取率为3.5%。

3 结论

以西兰花种子为原料提取萝卜硫素的最优工艺为：将粉碎好的西兰花种子用正己烷脱脂、过滤，调水溶液pH 值至4.0，水解12h，用乙酸乙酯萃取，并经硅胶柱层析提纯，提取率为3.5%，产品纯度超过95%。该方法简单易行，提取率稳定，可为工业化生产提供参考。

［1］HU R，XU C J，SHEN G X，et al.Gene expression profiles induced by cancer chemopreventive isothiocyanate sulforaphane in the liver of C57BL／6Jmice and C57BL／6J／Nrf2（－／－）mice［J］.Cancer Letters，2006，243（2）：170－192.

［2］KANT A K，SCHATZKIN A，GRAUBARD B I，et al.A prospective study of diet quality and mortality in women［J］.Journal of A－merican Medical Association，2000，283（16）：2109－2115.

［3］PERRY C L，McGUIRE M T，NEUMARK－SZTAINER D，et al.Adolescent vegetarians：How well do their dietary patterns meet the healthy people 2010objectives［J］.Archives of Pediatrics ＆Adolescent Medicine，2002，156（5）：431－437.

［4］SMITH－WARNER S A，SPIEGELMAN D，YAUN S S，et al.Intake of fruits and vegetables and risk of breast cancer：A pooled analysis of cohort studies［J］.JAMA，2001，285（6）：769－776.