基于二阶变换的高效液相色谱法测定食品中丙烯酰胺

徐立恒 王 笑 叶艳芬

(中国计量学院质量与安全工程学院，杭州 310018)

基于二阶变换的高效液相色谱法测定食品中丙烯酰胺

徐立恒 王 笑 叶艳芬

(中国计量学院质量与安全工程学院，杭州 310018)

针对方便面等面粉类食品中丙烯酰胺的测定，建立了基于二阶变换的高效液相色谱测定方法。该方法将二阶变换处理技术应用于HPLC的数据分析和处理，可以使食品样品HPLC图中丙烯酰胺色谱峰得到显著的锐化，大大提高定量分析的准确度和灵敏度。该方法测定丙烯酰胺的线性范围宽泛，定量检测限(LOQ)<10 μg/L，加标回收率为88.3%～91.0%，明显优于不经二阶变换处理的HPLC法。采用该方法对市售方便面样品进行测定，发现丙烯酰胺含量在10～300 μg/kg范围内，其含量小于薄脆饼干等常见的面粉类食品。

二阶变换 HPLC 信号处理 食品 丙烯酰胺

丙烯酰胺是食品在热加工过程中部分氨基酸和还原糖反应形成的产物，广泛存在于热加工的淀粉类食品中，比如油炸薯类制品、咖啡和谷物早餐[1-3]。由于丙烯酰胺具有潜在的神经毒性、遗传毒性和致癌性(IIA类)[4-5]，对人们的健康存在巨大威胁，自从2002年首次在食品中被发现以来引起了人们的高度重视。在我国人民的饮食结构中，小麦粉类食品包括煎、炸、烤等热加工工艺生产的面粉类食品占有重要的位置，建立小麦粉类食品中丙烯酰胺的检测方法、监测丙烯酰胺的浓度水平是评估丙烯酰胺摄入量和健康风险、指导食品加工工艺的必然要求。

高效液相色谱(HPLC)是复杂体系分离分析的良好手段，在食品中丙烯酰胺的测定中得到了广泛的应用[6-8]。但是对于丙烯酰胺含量很低的食品样品，普通的液相色谱很难满足测定要求，通常需要采用液相色谱串联质谱甚至质谱/质谱来进行分析，对仪器条件提出了更高的要求，很难在日常监测中应用。

二阶变换是一种简便的信号处理技术，可以有效的放大信号、增强峰的识别能力，并减少基线漂移等的影响，近年来在光谱信号处理以及定量定性分析中得到了广泛的应用[9-11]。将二阶变换信号处理技术应用于HPLC的数据分析和处理，可以使低浓度组分的较小色谱峰得到显著锐化，有效提高检测方法的灵敏度，有希望解决低含量组分的测定问题。本文采用二阶变换对HPLC的信号进行数据处理，建立适用于低含量食品中丙烯酰胺的高效液相色谱测定技术，并应用该方法对市售方便面样品丙烯酰胺含量进行了测定。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪：安捷伦科技有限公司；LG10-2.4A高速离心机：北京京立离心机有限公司；VisiprepTMDL固相萃取装置：美国Supelco公司；HC-C18固相萃取小柱：上海安谱科学仪器有限公司。

丙烯酰胺标准品(≥99%)、甲醇(色谱纯)、正己烷(色谱纯)：百灵威科技有限公司；其余试剂均为分析纯。CarrezⅠ试剂：15.00 g三水合亚铁氰化钾(K4Fe(CN)6·3H2O)溶解于水中并稀释至100 mL；CarrezⅡ试剂：30.00 g七水合硫酸锌(ZnSO4·7H2O)溶解于水中并稀释至100 mL。饼干样品为市场随机采集，均在保质期内，按要求条件贮藏。

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent公司ZORBAX SB-C18色谱柱；流动相：10%甲醇-水；流速：0.5 mL/min；进样量：15 μL；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm。

1.3 样品预处理

将方便面样品粉碎后准确称取样品5 g于100 mL烧杯中，加入30 mL水，磁力搅拌20 min后转入离心管中，以4 000 r/min转速离心30 min；移取上层清液于分液漏斗中，加入正己烷萃取3次以除去油脂；移取除脂后的样品液10mL于离心管中，分别加入CarrezⅠ、CarrezⅡ试剂各5 mL，混匀静置20 min后，以4 000 r/min转速离心20 min以除去蛋白质；上清液经活化的HC-C18固相萃取柱纯化，流出液用于HPLC分析。

2 结果与讨论

2.1 二阶变换信号处理应用于HPLC法定量分析

二阶变换是一种简便的信号处理方法，采用二阶变换对色谱流出曲线进行处理，可得：

式中：x为保留时间，y为信号强度。例如，图1a所示为丙烯酰胺标准样品在HPLC上进行分析得到的流出曲线，保留时间4.32 min的色谱峰即为丙烯酰胺的色谱峰。将HPLC流出曲线进行二阶求导变换，结果如图1b所示，流出曲线中丙烯酰胺的色谱峰变成了一个尖锐的倒峰。与原色谱峰相比，二阶变换以后的色谱峰峰高得到了显著的放大，并且峰宽明显变小，色谱峰变得更加尖锐、易于识别和分析。

HPLC法通常通过峰高或峰面积进行定量分析。

图1 丙烯酰胺标样的HPLC流出曲线(a)和经二阶变换处理的流出曲线(b)

在二阶变换以后的色谱图中，我们选用色谱峰峰高的绝对值作为丙烯酰胺定量分析的依据，得到的标准曲线见图2。如图2所示，在丙烯酰胺质量浓度为10～500 μg/L范围内，绝对峰高与丙烯酰胺的浓度呈良好的线性关系，其线性相关系数达0.999 8，可见二阶变换色谱图的绝对峰高完全可以作为定量分析的特征值，可以满足定量分析的要求。采用该方法对丙烯酰胺进行定量分析时线性范围宽泛，其定量限(LOQ)可低至10 μg/L，与文献报道的HPLC-MS/MS方法相当[6]。

图2 二阶变换处理色谱图的绝对峰高与丙烯酰胺浓度关系

2.2 食品样品色谱图的二阶变换

食品中丙烯酰胺的含量随食品种类、加工方式等的变化而不同，欧洲食品安全局对10 000多份样品检测结果表明，丙烯酰胺的含量在几十到几千μg/kg范围内[12]。对于丙烯酰胺含量较低的样品，直接HPLC法很难对其进行定量分析。

图3 某方便面样品的HPLC流出曲线(a)和二阶变换流出曲线(b)

图3a为一方便面样品的HPLC色谱图，由图3a可见，丙烯酰胺的色谱峰不明显，峰高较低且峰宽较大，与相近色谱峰分离不完全，而且色谱曲线的基线漂移明显，这些都为色谱峰的确认和峰面积的计算带来严重干扰，因此无法准确的进行定量分析。对该样品的色谱图进行二阶导数变换处理，结果如图3b所示，在保留时间4.32 min的色谱二阶导数峰变得非常尖锐，与相邻峰分离良好，经与加标样品相对比可以确认为丙烯酰胺的特征信号。因此，将二阶变换信号处理技术HPLC法相结合测定食品中的丙烯酰胺，可以大大提高定量分析的准确性和灵敏度。

2.3 基于二阶变换的HPLC法测定方便面中的丙烯酰胺

试验采用基于二阶变换的HPLC法对市售方便面样品的丙烯酰胺含量进行测定，首先考察该方法的回收率和精密度，以衡量测定方法可靠性。加标回收试验的结果如表1所示，可以发现基于二阶变换的HPLC法加标回收率在88.3%～91.0%之间，与不经二阶变换数据处理的经典HPLC法计算结果相对比，回收率普遍显著提高。在同一试验条件下同一方便面样品进行多次重复测定(n=8)，得到基于二阶变换的HPLC法的相对标准偏差(RSD)为5.8%。该方法回收率和精密度良好，能满足测定的需要。

表1 加标回收率试验结果

对超市销售的方便面随机抽取27个样品，按照基于二阶变换的HPLC法测定丙烯酰胺含量，每个样品重复测定3次(图4)。除3个样品未检出以外，其余方便面样品均含有丙烯酰胺，含量基本在10～300 μg/kg范围内，其中11个样品的丙烯酰胺含量小于50 μg/kg，大于150 μg/kg的样品有4个。与欧洲食品安全局的测定结果相对比[12]，方便面中丙烯酰胺的含量低于薄脆饼干和烘脆面包中丙烯酰胺的含量，与软面包的含量相当。尽管方便面的加工温度较高，但其比较低的糖含量可能减少了加工过程丙烯酰胺的形成。

图4 方便面样品的丙烯酰胺含量

3 结论

本研究将二阶变换数据处理技术应用于高效液相色谱分析法，建立了一种食品中丙烯酰胺的测定方法。二阶变换处理可以使食品样品HPLC图中丙烯酰胺色谱峰得到显著锐化，大大提高定量分析的准确度和灵敏度。基于二阶变换的HPLC法测定丙烯酰胺的线性范围宽泛，LOQ低至10 μg/L，加标回收率为88.3%～91.0%，明显优于不经二阶变换处理的HPLC法。该方法对仪器条件要求不高，数据处理简便，适用于复杂体系中低浓度组分的监测分析。采用该方法对市售方便面样品进行测定，发现丙烯酰胺含量为10～300 μg/kg，其含量小于薄脆饼干等常见的小麦粉类食品。

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Determination of Acrylamide in Foods by HPLC Based on 2-Order Transformation

Xu Liheng Wang Xiao Ye Yanfen
(College of Quality & Safety Engineering China Jiliang University, Hangzhou 310018)

To aim to the determination of the acrylamide content in foods, a determination method based on 2nd-derivative HPLC chromatogram was established in this paper. It was found that in the 2nd-derivative HPLC chromatogram of food, the peak of acrylamide was sharp and separated with neighboring peaks. The limit of quantification (LOQ) of the 2-order transformation-HPLC method for acrylamide was <10 μg/L, the standard addition recoveries was in a range of 88.3%～91.0%, the accuracy and sensitivity were superior to that of HPLC method. The instant noodle samples purchased from market were determined by this method, and the acrylamide contents in instant noodles were about 10～300 μg/kg, lower than crackers and bread crisp.

2-order transformation, HPLC, signal process, acrylamide, food

TS207.3,O657.7

A

1003-0174(2014)06-0108-04

国家质检总局质检公益性行业科研专项(201210016)

2013-06-19

徐立恒，女，1976年出生，副教授，有机污染物检测与食品安全