白酒中含氮类化合物定性分析方法

王 莉 ， 雷良波 ， 吴建霞 ， 徐 岩

（1.贵州茅台酒股份有限公司，贵州 仁怀 564501；2.江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122；3.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡214122）

吡嗪类化合物是白酒中一类重要的含氮类风味化合物，该类化合物风味阈值低，具有坚果香和焙烤香等怡人风味[1-4]，并对其它香味物质有明显的烘托叠加作用[5-6]。目前国内外对酒中吡嗪类化合物的分离方法有液液萃取、真空浓缩后液液萃取、吹扫捕集、固相萃取、离子交换和CO2超临界萃取等[7-12]。Wobben[13]等用减压蒸馏法除去酒中大部分乙醇和水，而后用CH2Cl2萃取，GC-MS分离和鉴定朗姆酒和威士忌酒中的吡嗪类化合物；Liebich[14]采用乙醚-戊烷混合溶剂抽提，再以10%HCl萃取分离，用GC-MS鉴定出朗姆酒中7种吡嗪类化合物；山东大学陆懋荪[15]利用阳离子树脂富集白酒中的含氮化合物，共检出12种吡嗪类化合物；余晓[16]等采用酸化萃取法对白酒中的含氮化合物进行研究分析，得出36种含氮化合物，其中27种吡嗪类化合物；徐占成[17]等采用液液萃取结合正相色谱分离技术应用全二维气相色谱-飞行气质联用仪 （GC×GC-TOFMS）检出剑南春酒32种吡嗪类化合物。

作者旨在探索一套更优的白酒中含氮类化合物的分析方法，深入分析茅台酒中含氮类化合物尤其是吡嗪类化合物，以更好地剖析茅台酒独特的风味特征。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要仪器 气相色谱质谱联用仪（GC7890A-5975C MSD）：色谱柱 DB-Wax （30 m×250.00 μm × 0.25 μm）， 美国安捷伦科技公司；R-200型旋转蒸发仪：瑞士BÜCHI公司；DC-12型氮吹仪：上海安谱科学仪器有限公司。

1.1.2 主要试剂及样品 53%（V/V）贵州茅台酒：贵州茅台酒股份有限公司；NaCl（分析纯）、H2SO4（分析纯）、NaOH（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、无水乙醚（分析纯）：购自上海国药集团；标准品：购自美国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 白酒样品预处理方法 取200 mL酒样，用2 mol/L的硫酸调整酒样酸度至 [H+]=1 mol/L后减压蒸馏至30 mL，转移至250 mL分液漏斗中，用50 mL重蒸乙醚萃取浓缩液，收集水相，用10%浓度的NaOH溶液调pH 13，静置冷却，无水乙醇调整酒精体积分数，适量NaCl过饱和，100 mL重蒸乙醚萃取上述溶液，收集有机相，用80 mL煮沸后冷却的去离子水洗涤萃取液，收集有机相，加入适量的无水Na2SO4干燥过夜后，N2吹浓缩至0.1 mL，GC-MS分析。

1.2.2 GC-MS分析条件 进样口温度为230℃，载气为He，流速1.3 mL/min；分流比5∶1，进样量1 μL。程序升温：起始温度50℃，保持2 min，然后以6℃/min的升温速率升温到230℃，保留20 min。

离子源温度230℃，四极杆温度150℃，接口温度280℃，EI源70 eV，scan方式扫描，质量范围30～550 Amu，溶剂延迟 5.00 min。

1.2.3 检出物质的定性 目标组分经NIST 08L Database（Agilent Technologies Inc.）标准谱库检索、标准品对比以及参考文献对比进行定性。

2 结果与讨论

2.1 白酒中吡嗪类化合物分析方法的优化

吡嗪类化合物是含有两个氮原子的碱性化合物，如：吡嗪的 pKa=0.65，2，5-DMP 的 pKa=1.85，这说明如果要从基质中萃取出更多的吡嗪类化合物，需要更低的pH值[18]。余晓等人曾报道将酒样调酸使[H+]=1 mol/L时，有90%的吡嗪类化合物成盐[16]。

作者比较了调整不同pH值后吡嗪类物质的萃取效率，综合考虑调酸对提取效率的影响及方法的可操作性，确定了用2 mol/L硫酸将酒样调酸至[H+]=1 mol/L的调酸方案。同时在方法优化的过程中考察了调酸、旋转蒸发浓缩及萃取流程单元的先后顺序，确定了酒样调酸、旋转蒸发浓缩、萃取的酒样预处理流程。

应用上述优化流程分析白酒样品，在分析过程中发现：白酒中大多数含氮类化合物的含量相对较小，易被种类繁多且含量较高的多元醇和酯类化合物掩盖，难以被检出定性。因此，如何去除多元醇和酯类化合物的干扰，是能否有效定性白酒中含氮类化合物的关键，见图1。作者以白酒中风味成分最为复杂的茅台酒为分析对象，对白酒中吡嗪及含氮类化合物提取方法进一步优化探索。

图1 未除多元醇和酯类化合物的茅台酒提取液的GC-MS总离子流图Fig.1 GC-MS TIC of moutai liquor extract without removing the esters and polyhydric alcohol

根据相似相溶原理，样品预处理时，在旋转蒸发回调pH至碱性后，引入适当回调乙醇浓度和水洗萃取相的提取纯化步骤，达到去除多元醇类化合物的目的。结果证明，上述步骤的引入能有效的去除多元醇类物质（如2，3-丁二醇等），含氮类化合物如：Pyrazine，3-butyl-2，5-dimethyl-、2-Isoamyl-6-methylpyrazine-等得以有效检出定性，见图2。

图2 除去多元醇和未除酯类化合物的茅台酒提取液的GC-MS总离子流图Fig.2 GC-MS TIC of moutai liquor extract by removing the esters

去除了酒样中多元醇类物质的干扰后，发现酯类物质的存在仍会遮盖部分目标提取物，进一步优化提取方案，在旋转蒸发浓缩后增加乙醚萃取去除酯类物质的步骤，再进行回调pH值等以下操作流程，提取结果见图3。在引入乙醚提取除酯步骤的基础上，再进行回调乙醇浓度、水洗除醇，可去除多元醇和酯类化合物的干扰，有效地降低了GC-MS总离子流图的基线，有利于 Pyrazine，2-ethyl-，6-methyl-、Pyrazine，trimethyl-等吡嗪类化合物的定性分析。

图3 除多元醇和酯类化合物的茅台酒提取液的GC-MS总离子流图Fig.3 GC-MS TIC of moutai liquor extract by removing the esters and rolyhydric alcohol

通过上述方法优化，确定了白酒中吡嗪类化合物分析的最佳提取流程：1）酒样调酸 （2 mol/L H2SO4）调酸度至[H+]=1 mol/L强度；2）旋转蒸发浓缩；3） 乙醚萃取除酯；4） 收集水相回调 pH；5） 调整提取液乙醇浓度；6）乙醚萃取；7）收集有机相后水洗除多元醇；8）干燥后氮吹浓缩。

2.2 茅台酒中吡嗪类及其他含氮类化合物定性结果

根据最优的白酒中吡嗪类及其它含氮类化合物定性分析方法制备茅台酒提取液，按照1.2.2的仪器分析条件进行GC-MS鉴定分析，通过对检出物的定性分析，共定性了35种吡嗪类化合物，分析结果较文献报道的白酒中吡嗪类化合物种类和数量均有增加，分析结果见图4及表1。除此之外，还有包括吡啶类、噻唑类、噻吩类、喹啉类等21种其它含氮类化合物被检出。

图4 茅台酒含氮类化合物定性分析总离子流图Fig.4 GC-MS TIC of nitrogenous compounds in Moutai Liquor

表1 GC-MS鉴定出的茅台酒中的吡嗪类化合物Table 1 Identification of pyrazines in moutai liquor by GC-MS

续表1

3 结语

作者在充分分析酒体风味物质组成并了解各类风味化合物性质的基础上，将白酒提取步骤的各个提取单元有机串联整合，并巧妙的引入除酯和除多元醇的提取纯化步骤，有效的提高了分析仪器对吡嗪类及含氮类化合物的检出率，形成了一套适用于白酒中吡嗪类化合物及其他含氮类化合物的有效定性分析方法。应用该方法共定性了茅台酒中56种含氮化合物，其中35种吡嗪类化合物、21种其它含氮类化合物，定性的结果较前人文献报道的茅台酒中的含氮类物质的种类、数量上均有所增加。本方法操作简单、易行，不需要特殊的仪器设备，为白酒中吡嗪及含氮类化合物的分析提供了新方法，为白酒风味物质分析提供了新思路。

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