固定化Pseudomonas putida CGMCC3830转化3-氰基吡啶制备烟酸

李 恒， 赵 欣， 杨 涛， 龚劲松， 朱小燕，熊 雷， 陆震鸣， 许正宏， 史劲松

（江南大学 药学院，江苏 无锡 214122）

烟酸是一种重要的医药中间体，广泛应用于医药、材料、日化、食品等行业[1]。烟酸的生产工艺主要采用氨氧化法、硝酸氧化法等化学合成法[2]。传统化学法生产烟酸存在反应条件苛刻、环境污染大、副产物多等缺点。随着绿色化学的发展，采用生物催化法制备烟酸受到越来越广泛的重视。

腈水解酶在羧酸的生物法合成方面一直是研究的热点[3]。目前，一系列具有腈水解酶活性的微生物被发掘和报道，如 Pseudomonas putida[4]，Bacillus subtilis[5]，Aspergillus niger[6]，Gibberella intermedia[7]等。利用酶法转化腈类化合物主要有纯酶及全细胞催化两种形式。与纯酶催化体系相比，全细胞催化具有稳定性高、转化成本低廉等优势[8]。而细胞固定化更进一步提高了生物催化剂的价值和效率。固定化细胞有利于产物的批量分离与提取，同时能够最大程度上保留酶的活性，增加细胞对底物的耐受性[9]，从而达到重复利用的目的[10]。固定化方法主要包括包埋法、交联法、吸附法和共价结合法，其中，包埋法具有温和的固定化条件以及良好的生物相容性。海藻酸钠、琼脂、卡拉胶、聚丙烯酰胺等均是常用的固定化材料[11]。由海藻酸钠与氯化钙交联生成的海藻酸钙凝胶成型快，酶活损失少，制备简单，是包埋法制备固定化细胞的首选材料。

作者所在研究室前期筛选获得了一株含有较高腈水解酶活性的P.putida CGMCC3830[12]，该菌在3-氰基吡啶、4-氰基吡啶生物催化合成烟酸和异烟酸的反应中表现出很高的转化效率。作者利用海藻酸钠固定Pseudomonas putida CGMCC3830，通过固定化及转化条件的优化，确定固定化P.putida CGMCC3830转化3-氰基吡啶合成烟酸的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种 P.putida，作者所在实验室筛选获得，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC 3830。

1.1.2 主要试剂和设备 3-氰基吡啶、烟酸：分析纯，Sigma公司；海藻酸钠、壳聚糖、氯化钙、甘油、尿素、亚硝基氰化钠等主要试剂：均为国产分析纯试剂。THZC型恒温振荡器：太仓市实验设备厂；电子天平：上海鹏顺科学仪器有限公司；Multitron培养振荡器：瑞士INFORS HT；日立微量高速离心机CF15RXII：日本日立公司。

1.1.3 培养基 种子培养基组分（g/dL）：甘油1，胰蛋白胨1，酵母粉0.5，氯化钠0.1，磷酸二氢钾0.1，磷酸氢二钾0.1。

发酵培养基在种子培养基的基础上增加尿素0.1 g/dL，调节pH 6.0。上述培养基均在121℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌体培养与菌悬液制备 接种：挑取单菌落接种于种子培养基中，在30℃、200 r/min培养24 h。扩大培养：向50 mL摇瓶中加入500 μL种子发酵液，在30℃、200 r/min条件下培养 48 h。在7 800 r/min、10℃下离心10 min，弃上清液，用生理盐水洗涤菌体，在相同条件下重复离心分离、洗涤操作，制成菌悬液，冰箱保存，备用。

1.2.2 海藻酸钠固定化细胞的制备 称取一定量的海藻酸钠，在50℃水浴中搅拌溶解，将海藻酸钠溶液与P.putida CGMCC3830菌悬液混合均匀后，用蠕动泵缓慢的将上述混合液滴入氯化钙溶液中成球固化。经PBS缓冲液（pH 7.0）洗涤3次置于4℃备用。

1.2.3 酶活力的测定及定义 酶活力的测定方法：取适量固定化细胞置于10 mL用磷酸缓冲液配置的100 mmol/L 3-氰基吡啶溶液中，在30℃摇床反应20 min，用2 mol/L的盐酸终止反应。过滤收集转化液，依次加入苯酚钠溶液1 mL，次氯酸钠1.5 mL，亚硝基铁氰化钠1.5 mL[13]，测定630 nm下OD值，计算产氨量。

一个单位酶活（U）的定义：在一定条件下，每分钟催化氰基水解产生1 μmol羧酸所需的酶量。

1.2.4 温度对固定化细胞的转化性能的影响 取等量的固定化细胞，分别在 25、30、35、40、45、50、60℃条件下，于10 mL体系中转化50 mmol/L 3-氰基吡啶，分别取样测定酶活。以最适温度下的酶活为100%，计算其他温度下样品的相对活力。

1.2.5 pH对固定化细胞的转化性能的影响 取等量的固定化细胞，在最适温度反应条件下，于10 mL体系中转化50 mmol/L 3-氰基吡啶，调节pH分别为 3.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、11.0，转化3-氰基吡啶，分别取样测定酶活。以最适pH下的酶活为100%，计算其他pH值下样品的相对活力。

1.2.6 底物浓度对固定化细胞的转化性能的影响取等量的固定化细胞，在最适反应条件下，分别考察底物浓度为 50、75、100、200 mmol/L 时对固定化细胞转化性能的影响，定时取样测定酶活，计算底物转化率。

1.2.7 固定化细胞与游离细胞的批次实验 为了评价和比较固定化细胞的重复使用性，将固定化细胞与游离细胞分别在浓度为100 mmol/L的3-氰基吡啶的反应体系中转化，转化60 min后将细胞滤出，用生理盐水清洗后进行下一批次的反应。

2 结果与讨论

2.1 海藻酸钠固定化条件的优化

2.1.1 海藻酸钠质量浓度的确定 考察包埋过程中海藻酸钠质量浓度对酶活力的影响。如图1所示，当海藻酸钠质量浓度低于2 g/dL时，随着其质量浓度的升高，固定化细胞的相对酶活逐渐增大；当海藻酸钠质量浓度为2 g/dL时，酶活最高。进一步提高海藻酸钠质量浓度，酶活反而降低，这与文献[5]报道类似。这是由于海藻酸钠的质量浓度过高导致凝胶网络过于致密，从而使得底物分子难以进入固定化小球内部进行转化，因此酶活降低。同时，海藻酸钠质量浓度过高也会造成小球成型的欠缺。因此，海藻酸钠的最适质量浓度为2 g/dL。

图1 海藻酸钠浓度对固定化细胞相对酶活的影响Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on the relative activity of the immobilized cell

2.1.2 氯化钙质量浓度对细胞酶活的影响 海藻酸钠包埋法的主要原理是基于Ca2+的架桥作用，使海藻酸钠形成空间网络状结构从而固定细胞，因此作为固定剂的氯化钙的质量浓度对固定化细胞的制备也有极大的影响。由图2可以看出，氯化钙质量浓度对固定化P.putida CGMCC3830酶活的影响与海藻酸钠的影响趋势相似。当氯化钙质量浓度为0.4 g/dL时，酶活最高；当氯化钙质量浓度高于0.4 g/dL时，酶活降低。这同样是由于高质量浓度的氯化钙造成底物或产物的扩散限制[14]。

图2 氯化钙浓度对固定化细胞相对酶活的影响Fig.2 Effect of CaCl2concentration on the relative activity of the immobilized cell

2.1.3 固化时间对细胞酶活的影响 固化时间对固定化细胞相对酶活的影响见图3。固化时间太短易导致凝胶交联不够充分，形成的凝胶网络结构松散，机械强度差。当固化时间为6 h时，凝胶致密程度适中，固定化细胞的酶活最高。进一步的固化会导致凝胶过于致密，酶活反而降低。因此选定最佳固化时间为6 h。

图3 固化时间对固定化细胞相对酶活的影响Fig.3 Effect of immobilization time on the relative activity of the immobilized cell

2.2 温度对固定化细胞转化性能的影响

温度对固定化细胞酶活力的影响见图4。当温度低于35℃时，固定化细胞酶活随着温度的升高而增加；高于35℃时酶活降低速率快，这是由于高温造成腈水解酶的失活。因此选择最适温度为35℃。

图4 温度对固定化细胞相对酶活的影响Fig.4 Effect of temperature on the relative activity of the immobilized cell

2.3 pH对固定化细胞转化性能的影响

反应体系中pH值直接影响酶的催化活性。如图5所示，当pH为7.0时，固定化细胞的酶活最高。pH过高或者过低，均易造成酶活力的降低。但固定化细胞对碱环境的耐受性较好，pH为11.0时，其相对酶活仍保留88.7%。

图5 pH对固定化细胞相对酶活的影响Fig.5 Effect of pH on the relative activity of the immobilized cell

2.4 固定化细胞底物浓度选择

底物浓度对固定化细胞相对酶活的影响见图6。底物浓度由50 mmol/L增加到100 mmol/L过程中，随着底物浓度的增加，固定化细胞转化3-氰基吡啶的速率逐渐减慢，底物完全转化所需时间逐渐延长。当底物浓度达到200 mmol/L时，底物转化率明显下降，180 min的转化率仅为17.4%。这是由于高底物浓度对细胞有有一定的毒害作用[15]，从而造成腈水解酶的失活。因此，选择100 mmol/L为最适底物浓度。

图6 不同浓度底物对固定化细胞酶活力影响Fig.6 Effect of substrate concentration on the relative activity of the immobilized cell

2.5 固定化细胞的批次转化

固定化细胞与游离细胞的批次转化效果见图7。可以看出，固定化细胞连续使用10次后，酶活保留59.1%，产物烟酸的得率为91.8 g/g干细胞重。而相同条件下，游离细胞使用3次后，酶活下降至45.6%，烟酸得率仅为24.6 g/g干细胞重。由此可见，P.putida CGMCC3830经过海藻酸钠包埋后，批次使用次数及产物得率均明显提高。

图7 固定化细胞批次转化性能Fig.7 Reuse of the immobilized cell

3 结语

作者采用包埋法对P.putida CGMCC3830细胞进行固定化，同时考察其转化3-氰基吡啶为烟酸的性能。以海藻酸钠为包埋材料，通过海藻酸钠质量浓度、氯化钙质量浓度以及固化时间等的优化，得到固定化最适条件为：海藻酸钠质量浓度2 g/dL，氯化钙质量浓度0.4 g/dL，固化时间6 h。进一步优化固定化细胞的转化条件，得到最适转化条件为：温度35℃，pH 7.0，底物浓度100 mmol/L。批次转化实验结果显示，当底物浓度为100 mmol/L时，固定化细胞可重复使用10次，酶活保留59.1%，烟酸得率为91.8 g/g细胞干重，比游离细胞提高了2.7倍。由此可见，P.putida CGMCC3830经固定化后，单位细胞的转化能力以及使用稳定性均显著提高。

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