磷酸二酯酶抑制剂对枯草芽孢杆菌发酵环磷腺苷的影响

朱晓宏， 朱晓慧， 魏 薇

（江苏省微生物研究所有限公司，江苏 无锡 214063）

环磷腺苷具有调节生物体内很多酶催化反应的功能，体内很多激素的作用也是通过环磷腺苷区进行的，起着激素媒介物质的作用[1]。

现已证明环磷腺苷（cAMP）是睾丸甾酮、雌激素、肾上腺激素、甲状腺激素及胎盘激素等许多激素的第二信使。当各种激素与细胞表面作用点接触时，发动细胞内三磷酸腺苷（ATP）转化成环磷腺苷（cAMP）。细胞内环磷腺苷（cAMP）的浓度变化又引起了细胞各种代谢的变化。而且环磷腺苷（cAMP）与细胞内蛋白质合成、脂肪分解、类固醇合成均有关系。环磷腺苷（cAMP）与恶性肿瘤、内分泌之间的关系十分密切。在特定条件下，环磷腺苷（cAMP）对癌细胞具有控制作用，对冠心病、牛皮癣等有缓解作用。

目前在我国，环磷腺苷（cAMP）主要作为医药品被应用。环磷腺苷（cAMP）在医药上主要作为急性心肌梗塞抢救药并用于冠心病、糖尿病、气喘、牛皮癣等疾病的治疗。

生物代谢途径中，磷酸二酯酶及其同工酶能够使环磷腺苷降解[2]，破坏磷酸二酯酶及其同工酶，成为提高环磷腺苷发酵水平的有效途径。

本研究采用菌种枯草芽孢杆菌Bacillus.subtilis jsim-1277已经是腺苷酸脱氨酶阴性[3]减少了磷酸二酯酶活性，作者试验了多种磷酸二酯酶同工酶抑制剂，有效提高了环磷腺苷的发酵水平。

1 材料与方法

1.1 菌种

作者所在研究室筛选育种得到的Bacillus.subtilis jsim-1277。该菌株与目前国内鸟苷发酵菌种Bacillus.subtilis jsim-G518[4]相似，同样源自肌苷产生菌Bacillus.subtilis jsim-1019。

1.2 培养基

1.2.1 种子培养基 葡萄糖2.0 g/dL，蛋白胨1.0 g/dL，玉米浆 0.3 g/dL，NaCl 0.3 g/dL；pH 7.0。 （固体培养基加琼脂2 g/dL）

1.2.2 发酵培养基 葡萄糖6.0 g/dL，尿素1.0 g/dL，酵母粉1.0 g/dL，豆饼水解液0.3 g/dL，K2HPO41.0 g/dL，NaF 0.05 g/dL，MgSO40.1 g/dL；pH 7.0。依据实验需要添加 1，5，10，20，50 mg/L 的酚噻嗪、 西马多丁、硫苯唑林、丙苯氮嘌呤、茶碱等磷酸二酯酶抑制剂。

1.3 摇瓶发酵试验

1.3.1 摇瓶种子培养 接一环生长良好的斜面培养物至装有30 mL种子培养基的500 mL三角瓶中培养，旋转式摇床，频率210 r／min，温度36℃ ，培养18 h。

1.3.2 摇瓶发酵培养 将生长良好的种子液接至装有30 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中培养，接种体积分数10%，旋转式摇床，频率210 r／min，温度36℃，培养72 h后测定环磷腺苷质量浓度。培养条件与鸟苷发酵条件相似[5]。

1.4 分析方法

高效液相色谱法。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液 （含0.01 mol/L四丁基溴化铵，用磷酸调节pH值至4.3）-乙腈（85∶15）为流动相，检测波长为258 nm。标准品溶液0.2 mg/mL，取20 μL注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算测定。

2 结果与分析

2.1 酚噻嗪的影响

在发酵培养基中添加了 1、5、10、20、50 mg/L 的酚噻嗪，与不添加的常规培养基发酵进行对照，结果见表1。

表1 酚噻嗪对环磷腺苷发酵的影响Table 1 Effect of various concentration of phenothiazine on cAMP accumulation

酚噻嗪的加入非但没有提高，还大大降低了环磷腺苷的生产能力。发酵过程中，菌自溶时间提前，可能与酚噻嗪对菌种具有毒性有关。

2.2 西马多丁的影响

在发酵培养基中添加了 1、5、10、20、50 mg/L 的西马多丁，与不添加的常规培养基发酵进行对照，结果见表2。

表2 西马多丁对环磷腺苷发酵的影响Table 2 Effect of various concentration of cemadotin on cAMP accumulation

西马多丁在低浓度可以提高环磷腺苷的生产能力，在5 mg/L添加量时，可以提高产量16%，而添加量过大则反而减产。可能与西马多丁对磷酸二酯酶同工酶的抑制有关。

2.3 硫苯唑林的影响

在发酵培养基中添加了 1、5、10、20、50 mg/L 的硫苯唑林，与不添加的常规培养基发酵进行对照，结果见表3。

表3 硫苯唑林对环磷腺苷发酵的影响Table 3 Effect of various concentration of thibenzazoline on cAMP accumulation

硫苯唑林的加入同样没有提高，并大大降低了环磷腺苷的生产能力。发酵过程中，菌自溶时间也提前，可能与硫苯唑林对菌种具有毒性有关。

2.4 丙苯氮嘌呤的影响

在发酵培养基中添加了 1、5、10、20、50 mg/L 的丙苯氮嘌呤，与不添加的常规培养基发酵进行对照，结果见表4。

表4 丙苯氮嘌呤对环磷腺苷发酵的影响Table 4 Effect of various concentration ofbenzene nitrogen purine on cAMP accumulation

丙苯氮嘌呤的加入同样没有提高，并大大降低了环磷腺苷的生产能力。发酵过程中，菌自溶时间提前更明显，可能与丙苯氮嘌呤对菌种具有毒性有关。

2.5 氨茶碱的影响

在发酵培养基中添加了 1、5、10、20、50 mg/L 的氨茶碱，与不添加的常规培养基发酵进行对照，结果见表5。

氨茶碱可以提高环磷腺苷的生产能力，在5 mg/L添加量时，可以提高产量10.7%，随着添加质量浓度的提高，环磷腺苷增产能力维持在9%～10%左右，可能与氨茶碱对某类磷酸二酯酶同工酶产生了抑制有关。

表5 氨茶碱对环磷腺苷发酵的影响Table 5 Effect of various concentration of aminophylline on cAMP accumulation

2.6 西马多丁与氨茶碱联合使用的影响

西马多丁与氨茶碱共同使用，按照之前试验中最佳的3个质量浓度组合，结果见表6。

表6 西马多丁与氨茶碱联用对环磷腺苷发酵的影响Table 6 Effect of cemadotin combined with aminophylline on cAMP accumulation

西马多丁和氨茶碱联用，具有提高环磷腺苷的生产能力，且提高能力相互间有加成效果，可能西马多丁和氨茶碱分别抑制的磷酸二酯酶同工酶类别不同，协同减少了菌对自身产物环磷腺苷的降解，实现了增产的效果。

3 结语

环磷腺苷产生菌枯草芽孢杆菌Bacillus.subtilis jsim-1277能在某些磷酸二酯酶同工酶抑制剂的存在下，提高环磷腺苷的产量。其中西马多丁和氨茶碱联用，最多可以增产28%，达到9.14 g/L，提高非常显著。

[1]Shandar R R，Zhu J S，Baron A D.Glueosamine infusion in rat smimics the beta-cell dysfunction of non-insulin-dependent diabetes mellitus[J].Metabolism，l998，47：573．

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[4]盛翠，张一平，陆茂林.原生质体紫外诱变选育鸟苷高产菌株[J].食品与生物技术学报，2009，28（2）：279-283.SHENG Cui，ZHANG Yiping，LU Maolin.Study on breeding up high-yield strain of guanosine by protoplast mutagensis[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2009，28（2）：279-283.（in Chinese）

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