革木蜜的抗氧化活性*

贾歌，王远，丰凡，程妮，赵静，曹炜，2

1(西北大学化工学院/西北大学蜂产品工程技术研究中心，西安，710069)

2(陕西省蜂产品工程技术研究中心，西安，710065)3(中国农业科学院蜜蜂研究所，北京，100093)

自由基生物医学研究认为，机体中存在过多自由基可以直接攻击细胞中的蛋白质、DNA和脂质，从而导致细胞受损，引发很多疾病［1－2］。流行病学调查发现，每日摄取一定量的蔬菜、水果、谷物，可以有效对抗动脉粥样硬化和降低癌症发病率其原因可能与其中含有大量的抗氧化成分有关。

近年来，蜂蜜的抗氧化活性受到广泛关注，蜂蜜不仅在体外具有抗氧化活性，在体内也有作用，这与蜂蜜中含有丰富的抗氧化成分有关［3－4］。曹炜等人研究发现，产自中国的槐花蜜、苹果蜜、枸杞蜜、荞麦蜜、山楂蜜等10种蜂蜜，对超氧阴离子自由基和脂质过氧化有明显的抑制作用［5］。Isabel等人研究葡萄牙东北部的迷迭香蜜、石南蜜和牛舌草蜜的抗氧化活性，发现迷迭香蜜对DPPH自由基有较强的清除能力和抑制脂质过氧化作用［6］。Zhou等人发现，荞麦蜜对羟基自由基氧化损伤的DNA有较强的保护作用［7］。Saxena等采用FRAP法和DPPH法研究了印度蜂蜜的抗氧化活性，发现印度蜂蜜对自由基清除能力与酚酸含量呈正相关［8］，表明印度蜂蜜的抗氧化活性与其中含有的酚类化合物有关。Al-Mamary等人测定了也门产的5种蜂蜜的抗氧化活性，发现所有的蜂蜜对猪肝匀浆脂质过氧化的抑制率均超过50%，且蜂蜜的抗氧化能力与总酚含量呈高度相关［9］。

革木蜂蜜产自澳大利亚南部塔斯马尼亚岛［10］，色泽呈金黄色、质感粘稠、香味浓郁，深受消费者的喜爱。目前，关于革木蜜中的抗氧化活性未见文献报道。本文采用体外法对革木蜂蜜的抗氧化活性进行了研究，并与洋槐蜜和荞麦蜜进行了。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

1.1.1 材料

革木蜜，由宁波保税区圣鲸酒业有限公司提供(Australian Honey Products P/L-Tasmania 7250 Australia出品)，洋槐蜜和荞麦蜜，由陕西老蜂农生物有限责任公司提供。样品信息见表1。

表1 单花蜜样品信息表Table 1 Unifloral samples information table

1.1.2 试剂

1，1-苯基-2 苦肼基自由基(DPPH)、3-(2-吡啶基)-5，6-双(4-苯磺酸)-1，2，4-三嗪(Ferrozine 试剂)、2，4，6-三吡啶基-1，3，5-三嗪(TPTZ)，Sigma 公司产品。GoldViewⅠ型核酸染色剂，北京赛百盛基因技术有限公司产品。没食子酸、硫酸亚铁(FeSO4)、Na2HPO4、乙二氨四乙酸(EDTA)、NaH2PO4、三氯化铁(FeCl3)等，均为市售分析纯试剂。琼脂糖，北京鼎国生物技术有限责任公司产品。XAD-2大孔树脂，上海摩速科学器材有限公司产品。pBR322 DNA，TaKaRa生物技术公司产品。

1.2 实验仪器

电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)，HH-2数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)，UV751-GD紫外/可见分光光度计(上海分析仪器总厂)，D-9143B-1型鼓风干燥箱(上海福玛实验设备有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 革木蜜总酚含量和总黄酮含量的测定

1.3.1.1 总黄酮含量的测定［11］

(1)黄酮的提取:准确称取样品10 g，加90 mL蒸馏水溶解并定容至100 mL，将XAD-2大孔树脂装入柱中并水洗至无醇味，然后用玻璃棒将蜂蜜溶液缓慢转入柱中。用大于200 mL的酸水和蒸馏水将糖等极性化合物洗脱，再用200 mL甲醇洗脱至无色，收集甲醇洗脱液，40℃减压浓缩至干，用甲醇定容至25 mL容量瓶中，作为供试液。

(2)标品的配置:精确称取在105℃条件下干燥至恒定质量的芦丁标准品100.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇，微热溶解，放冷后再加入甲醇稀释至刻度，摇匀，得到1 mg/mL的芦丁标准品。

(3)标准曲线绘制:分别精确吸取芦丁标准品溶液0、10、20、30、40、50 μL 于10 mL 试管中，加入甲醇定容至4 mL，加入5%的亚硝酸钠0.4 mL充分摇匀，静置6分钟，加入10%的硝酸铝0.4 mL，静置6分钟，再加入4%氢氧化钠4 mL，用甲醇定容至10 mL，静置15分钟，在430 nm处测其吸光度。

1.3.1.2 总酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteu比色法［12］测定。以对照品的吸光度和对照品的浓度(mg/mL)进行线性回归，求得标准曲线和相关系数。回归方程:y=0.099 3x+0.136 8(R2=0.997 0)。蜂蜜总酚含量以没食子酸的相对量表示。

1.3.2 革木蜜对DPPH自由基的清除实验

采用 Yokozawa［13］和 Larrauri［14］的方法进行。吸取一定量稀释后的蜂蜜样品，加入0.025 mg/mL的DPPH甲醇溶液3 mL，用蒸馏水定容至5 mL。在室温、避光条件下放置1 h后于516 nm处测吸光度。DPPH的清除率用以下公式计算:

DPPH自由基清除率/%=(1－A”1/A0)×100

式中A0为体系中空白吸光度(没有加入样品);A1为某时刻溶液中样品的吸光度。清除50%DPPH自由基时所需蜂蜜的量，即为所测样品的 IC50值。IC50值越小，表明蜂蜜的抗氧化活性越大。

1.3.3 革木蜜对Fe3+还原能力(FRAP)实验

革木蜜对Fe3+还原力参考Tuberoso等人［15］的实验方法并适当进行改进。移取0.2 g/mL的蜂蜜溶液0.5 mL于10 mL试管中，然后加入4 mL TPTZ工作液(包含2.5 mL的10 mol/L TPTZ溶液，2.5 mL的20 mmol/L FeCl3溶液及25 mL的300 mmol/L pH为3.6的醋酸盐缓冲液)，混匀后37℃反应10 min，在593 nm测定吸光度。

1.3.4 革木蜜对Fe2+络合力实验

标准曲线的绘制:分别移取 0、60、120、180、240、300、360 μL Na2EDTA(1 mg/mL)溶液于 10 mL 试管中，加入 FeSO4(1 mM)100 μL，ferrozine(1 mol/L)300 μL，用甲醇定容至3 mL，然后在562 nm处测定吸光度。回归方程:y=－71.900x+0.920 1(R2=0.997 8)。

将稀释后的蜂蜜样品吸取200 μL于10 mL试管中，加入 100 μL 1 mM FeSO4溶液，300 μL 1 mol/L ferrozine溶液，用甲醇定容至3 mL，于562 nm处测定吸光度。

1.3.5 革木蜜对羟基自由基致DNA氧化损伤的保护实验

将琼脂糖加热熔化，于25 mL琼脂糖中趁热加入1 μL GoldView染色。在1.5 mL离心管中加入1 μL 0.25 μg pBR322 DNA，1 μL 1 mmol/L FeSO4，1 μL 1%H2O2，5 μL 蜂蜜样品溶液，用50 mol/L PBS 缓冲液(pH=7.0)定容至15 μL，充分混合，置于37℃温浴30 min，用Loading buffer染色，然后在0.8%的琼脂糖凝胶中避光电泳，电泳结束后放凝胶于凝胶呈像仪中呈像，用Quantity One 4.6.2软件(Bio-Rad公司)进行DNA损伤度评价。

1.4 统计分析方法

数据以¯x±s表示。方差分析采用SPSS 13.0分析软件中ANOVA单因素分析，P＜0.05说明有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 蜂蜜样品的总酚含量和总黄酮含量

由表2可知，3种蜂蜜样品间的总酚含量和总黄酮含量有显著差异。荞麦蜜中总酚含量和总黄酮含量分别为(127.63±4.41)μg/g、(0.058 16±0.002)mg/g，显著高于革木蜜和洋槐蜜的总酚含量和总黄酮含量。3种蜂蜜的总酚和总黄酮含量顺序为:荞麦蜜＞革木蜜＞洋槐蜜。3种不同蜂蜜样品中的总黄酮含量远小于总酚含量，由此可见，革木蜜中抗氧化成分主要为酚酸。曹炜［16］等人报道的荆条蜜、党参蜜、黄芪蜜、枸杞蜜和枇杷蜜的酚酸含量，革木蜜酚酸含量与荆条蜜相当，但显著高于党参蜜、黄芪蜜和枸杞蜜。革木蜜中总黄酮的含量大于椴树蜜黄酮［17］。

2.2 革木蜜对DPPH自由基的清除作用

DPPH是一种稳定的自由基，常用于评价天然抗氧化剂和提取物的抗氧化活性。本文考察了革木蜜对DPPH自由基的清除活性，并与荞麦蜜和洋槐蜜进行了比较，结果见图1。由图1可知，革木蜜、洋槐蜜和荞麦蜜清除DPPH自由基的能力不尽相同，且样品浓度增加时清除率随之增强。对图1进行曲线拟合得出各种蜂蜜的IC50值。革木蜜、荞麦蜜和洋槐蜜对DPPH自由基的IC50值分别为(0.080 6±0.005)、(0.036 2 ±0.004)、(0.366 ±0.021 2)g/mL。由此可见，革木蜜对DPPH自由基的清除活性高于洋槐蜜，但低于荞麦蜜。相关性分析表明，蜂蜜样品对DPPH自由基与酚酸含量呈正相关(R=0.82)，与黄酮含量也呈正相关性(R=0.93)，由此说明，黄酮及酚酸是3种蜂蜜清除DPPH自由基的主要成分，且黄酮类化合物对DPPH自由基的清除活性更显著。

图1 蜂蜜对DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging activities of honey samples on DPPH radicals

2.3 革木蜜对Fe3+还原能力(FRAP)

FRAP法测定总抗氧化能力的原理是在低pH值的环境下，生物活性物质能够将三吡啶三嗪三价铁还原为蓝色的三吡啶三嗪二价铁，在593 nm测定蓝色的Fe2+-TPTZ即可获得样品中的总抗氧化能力。FRAP是唯一直接测定样品抗氧化活性的方法。由表2可知，革木蜜对Fe3+的还原力远高于洋槐蜜，但低于荞麦蜜。最强与最弱之间相差11倍。与Bertoncelj等人测定的刺槐蜜、柠檬蜜、栗子蜜和云杉蜜等几种单花蜜的 FRAP值相比［18］，革木蜜的 FRAP值显著高于刺槐蜜、柠檬蜜、栗子蜜和云杉蜜的FRAP值。总酚含量与3种蜂蜜的FRAP值相关系数为R=0.99，表明3种蜂蜜对Fe3+的总抗氧化能力与总酚含量有关。酚类化合物具有较强的还原性，因而具有较强的提供电子能力，这也是蜂蜜能够还原Fe3+的主要原因，也是蜂蜜发挥抗氧化活性的化学本质。

表2 蜂蜜样品总酚含量，总黄酮含量和对Fe3+还原能力(¯x ± s)Table 2 The total phenolic，total flavonoids contents and FRAP of honey samples(¯x ± s)

2.4 革木蜜对Fe2+的络合力

络合过渡金属离子是评价抗氧化活性大小的重要指标之一。过渡金属离子可以催化脂质过氧化反应，抗氧化物通过络合金属离子实现减缓脂质过氧化反应，从而起到抑制脂质过氧化的作用。Ferrozine能够与Fe2+定量发生络合生成蓝色物质，能将金属离子有效络合，当反应体系存在其他络合物时(例如黄酮类化合物)，该物质能够争夺Fe2+使得蓝色变浅，颜色越浅表明络合能力越强［19］。由图2可知，在3种蜂蜜中，洋槐蜜对Fe2+的络合力最强，其络合力为1 g洋槐蜜相当于0.209 mg Na2EDTA，荞麦蜜对Fe2+络合力最弱。由此可见，酚酸含量与Fe2+络合力无明显相关性，这与Zhou等人研究的总酚含量最高的荞麦蜜样品并不是Fe2+络合力最强的样品结果一致［6］。由于这3种蜂蜜来自不同的蜜源，其含有的抗氧化活性物质不同，酚类化合物的结构也不同，因此对Fe2+络合能力不同［20］。此外，蜂蜜中可能存在一些其他抗氧化物质，也可能影响其对Fe2+的络合能力。

2.5 革木蜜对羟基自由基致pBR322 DNA氧化损伤的保护作用

图2 蜂蜜对Fe2+的络合力Fig.2 The iron chelation of honeys

在羟基自由基诱导的DNA损伤中，未处理的质粒pBR322 DNA主要以超螺旋型形式存在(见泳道1)。当在体系中加入H2O2和Fe2+后发生Fenton反应，产生羟基自由基，进而导致DNA发生氧化损伤。氧化损伤后的DNA超螺旋结构转变为开环型和直链型DNA，电泳速度明显慢于超螺旋结构(见泳道2)。由图3可知，对照组的 DNA超螺旋结构比例为83.3%(泳道1)，为经损伤后的DNA超螺旋结构比例下降为38.6%(泳道2)，表明DNA发生严重的氧化损伤。当在体系中加入3种蜂蜜后，超螺旋结构比值分别为71.5%、56.7%和73.1%，显著高于氧化损伤组(泳道2)，表明3种蜂蜜对羟基自由基诱导的pBR322 DNA氧化损伤均有显著的保护作用(泳道3～5)。其中革木蜜对羟基自由基诱导的 pBR322 DNA氧化损伤的保护能力介于洋槐蜜和荞麦蜜之间。表明革木蜜是一种活性较强的DNA氧化损伤保护剂。

图3 蜂蜜样品对羟基自由基致pBR322 DNA氧化损伤的保护作用泳道1:空白(只含pBR322 DNA);泳道2:H2O2+Fe2++pBR322 DNA;泳道3－5:H2O2+Fe2++pBR322 DNA+1 μL浓度为0.2 mg/mL的革木蜜、洋槐蜜和荞麦蜜样品(DNA损伤保护)。Fig.3 Protective activity of honey samples on hydroxyl radical-mediated DNA damage.Lane 1，no addition(only pBR322 DNA);Lane 2，FeSO4，H2O2and pBR322 DNA;Lanes 3 －5，FeSO4，H2O2，pBR322 DNA and 1 μl leatherwood honey，acacia honey and buckwheat honey samples with concentration of 0.2 mg/ml，respectively(DNA damage protection).

活性氧是导致DNA氧化损伤主要原因，尤其是羟基自由基具有极强的攻击能力，直接导致DNA开环、碱基修饰甚至发生断链。虽然机体内有一套修复DNA氧化损伤的机制，能够及时修复氧化损伤后的DNA分子，但外源抗氧化剂对预防氧化应激导致的生物大分子损伤至关重要。蜂蜜中含有大量的抗氧化成分，在体内和体外均具有显著的抗氧化活性［3，21］。本文研究结果表明，革木蜜的总酚含量虽显著低于荞麦蜜，但二者对DNA氧化损伤的保护能力未见显著差异，且革木蜜对Fe2+的络合力显著高于荞麦蜜(P＜0.05)，表明革木蜜对羟基自由基诱导DNA损伤的保护作用可能通过清除羟基自由基和络合Fe2+双重机制发挥作用，其分子机理有待进一步深入研究。另外革木蜜中的主要抗氧化成分的结构也需要进一步表征，为揭示其抗氧化的分子机制和构效关系提供依据。

3 结论

(1)体外实验表明，革木蜜对DPPH自由基有较强的清除活性，IC50值介于荞麦蜜和杨槐蜜之间;FRAP实验表明，革木蜜具有的还原力显著高于杨槐蜜，但低于荞麦蜜。

(2)革木蜜对羟基自由基致DNA氧化损伤有显著的保护作用，这可能与革木蜜具有较强的还原力和对过渡金属的络合力有关。

(3)革木蜜的抗氧化活性与总酚含量有关。本文的研究结果显示，革木蜜是一种具有抗氧化保健功能的天然食品。

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