高效液相色谱法测定糕点中的柠檬黄、日落黄

刘芳

(北京市昌平区质量技术监督局，北京 102200)

近年来，柠檬黄、日落黄等色素超标而导致食品被禁止销售在国内外屡次出现，成为食品不合格的重要因素之一。合成色素有一定毒性，食用过多会危害人体健康［1］。我国卫生部发布的GB 2760-2011《食品添加剂使用卫生标准》中明确规定糕点中不得检出柠檬黄、日落黄［2］。

目前，国标方法［3］的样品处理步骤较为繁琐，所用试剂有强烈的刺激性气味，而且糕点样品的抽滤通常十分困难，同时国标方法采用的流动相和测定波长容易使目标峰受到杂质干扰。通过查阅资料及多次分析实验，采用水浴浸提的方法提取糕点中的柠檬黄、日落黄，采用离心取上清液的方法净化样品［4］，并改变了流动相的梯度淋洗比例和测定波长，简化了分析步骤，避免了杂质干扰，提高了检测灵敏度，获得了较为满意的回收率。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Agilent 1200型，美国安捷伦公司；

快速混匀器：GL-88B型，海门麒麟医用仪器厂；

恒温水浴锅：XMTD-4000型，北京君豪科技发展有限公司；

高速离心机：3K30型，博励行仪器有限公司；

柠檬黄标准溶液［GBW(E) 100001a］：500 mg／L，中国计量科学研究院；

日落黄标准溶液［GBW(E) 100003a］：500 mg／L，中国计量科学研究院；

甲醇：色谱纯，美国Fisher Scientifi c公司；

乙酸铵：分析纯，广东汕头市西陇化工厂；

实验室用水经Millipore超纯水系统纯化。

1.2 色谱条件：

色 谱 柱：Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；紫外检测器；检测波长：柠檬黄为430 nm,日落黄为482 nm；柱温：40℃；流动相：A为甲醇，B为0.02 mol／L乙酸铵溶液，流量为1.0 mL／min；梯度洗脱程序：0～7 min时15% A+85% B，7～14 min时40% A+60% B，14～16 min时15% A+85% B；进样量：10 μL；

1.3 实验方法

称取5.00 g粉碎均匀的样品于100 mL比色管中，加入50 mL水，于快速混匀器中涡旋混匀，然后于60℃水浴1 h，期间颠倒混匀几次，浸泡放置过夜，取上清液以4 000 r／min离心5 min，用带针注射器吸取上清液供测定。以标准曲线外标法定量。

1.4 色谱图

按照1.2色谱条件测定样品溶液，色谱图见图1。由图1可知，在改变了流动相梯度淋洗比例和变换测定波长后，延缓了目标峰的出峰时间，可避免样品中杂质峰的干扰，有较高的灵敏度。

图1 柠檬黄、日落黄样品色谱图

2 结果与讨论

2.1 样品处理方法

使用高效液相色谱仪测定食品中的着色剂，国家标准方法中的聚酰胺吸附法［3］依据水溶性酸性色素在酸性条件下被聚酰胺吸附，然后在碱性条件下解吸附［5］，但利用甲醇-甲酸(60∶40)的混合液洗脱天然色素和其它杂质时会造成合成着色剂损失，而且糕点样品在使用G3垂融漏斗抽滤时通常十分困难。笔者曾采用乙醇-氨水直接提取色素或用滤纸及布氏漏斗代替G3垂融漏斗等多种方法尝试，均未得到满意结果。通过查阅资料及多次分析实验，依据柠檬黄、日落黄为水溶性色素，与其它溶剂相比它们在水中的溶解度最大［6］，且其溶解度随温度升高而增大，二者耐热性较强［7］，参考国标方法的水浴温度，采用水浴浸提的方法提取糕点中的柠檬黄、日落黄，得到满意效果。

由于糕点成分复杂，加标后的样品有的很容易就可以将色素提取到水中，如月饼、麻花；而有的样品则较困难，如面包、饼干；但经过涡漩混匀、水浴加热及浸泡过夜后，均可获得较高的回收率。实验发现用0.45 μm滤膜过滤会造成色素较大损失，所以采用离心的方法，取上清液测试［4］，虽然溶液下层残渣中仍有少量着色剂吸附，但和用0.45 μm滤膜过滤相比损失较小。离心可以使杂质等颗粒物质沉淀，尽可能达到去除此类物质的目的。离心后，糕点中的油脂会漂浮于液面上层，这一小部分油脂对于检测没有太大影响，但对色谱柱污染较大，如果使用吸附剂或层析填料则会造成着色剂提取损失，所以使用一次性带针注射器穿过油脂吸取中间水层，这样可使油脂的残留很小。

如果浸提用水偏酸性，则有可能产生色素酸沉淀，给检测带来影响，所以提取过程中使用中性水。

2.2 仪器条件优化

国家标准方法所采用的254 nm波长虽然能够同时对多种色素进行测定，但是干扰物质较多，尤其柠檬黄出峰时间较早，易与样品干扰峰叠加。所以改变甲醇、乙酸铵溶液的梯度淋洗比例，并采用柠檬黄、日落黄有最大吸收波长的430 nm和482 nm［7-8］测定。

2.3 线性方程与检出限

分别准确吸取500 mg／L柠檬黄、日落黄标准溶液0，0.5，1.0，2.0，4.0 mL，用水定容至100 mL，配制成质量浓度为0，2.5，5.0，10.0，20.0 mg／L的柠檬黄、日落黄系列混合标准工作溶液，按1.2色谱条件测定，以质量浓度X为横坐标、峰面积Y为纵坐标进行线性回归，得柠檬黄线性方程为Y=31.067X+4.848 2，r2=0.999 7，日落黄线性方程为Y=32.01 9X+0.829 7，r2=0.999 9。

按3倍信噪比计算检出限，得到柠檬黄检出限为0.4 mg／kg，日落黄检出限为0.3 mg／kg。

2.4 精密度试验

取同一批样品加入标柠檬黄、日落黄标准混合液，按1.2色谱条件进行测定，结果见表1。

表1 精密度试验结果

由表1可知，柠檬黄、日落黄测定结果的相对标准偏差分别为4.8%，3.7%，说明方法的精密度良好。

2.5 回收试验

吸取适量柠檬黄、日落黄标准溶液加入糕点样品中，按1.2色谱条件进行测定，结果见表2。由表2可知，柠檬黄的回收率为72.5%～77.2%，日落黄的回收率为73.2%～82.0%，说明该方法的准确度较高。

表2 回收试验结果

3 结语

建立了糕点中柠檬黄、日落黄的高效液相色谱分析方法。本方法样品处理简单，避免了杂质干扰，提高了灵敏度，可以满足糕点中柠檬黄、日落黄的测定要求。

［1］米尔芳，王彩云，赵霞，等.可见光区多种波长梯度洗脱同时测定六种色素的方法研究［J］.实用医技杂志，2009，16(6): 489-490.

［2］GB 2760-2011 糕点中柠檬黄、日落黄的限量［S］.

［3］GB／T 5009.35-2003 食品中合成着色剂的测定［S］.

［4］鄢兵，龙洲雄，万春花，等. HPLC法同时测定饮料中柠檬黄和日落黄［J］.现代测量与实验室管理，2007(4): 14-14.

［5］徐春祥，王峰，赵维佳.高效液相色谱法测定火腿肠中的诱惑红［J］.化学分析计量，2005，14(1): 12-13，55.

［6］管敏娅，张立义.食品中5种合成食用色素高效液相色谱检测方法的探讨［J］.中国卫生检验杂志，2008，18(6): 1 105-1 106.

［7］冯慧，梅利华，谢继安.高效液相色谱检测蜜饯中合成色素的最佳测定波长研究［J］.中国食物与营养，2007(9): 39-41.

［8］程小会，邓敬颂.液相色谱法测定果蔬汁中柠檬黄和日落黄方法优化［J］.化学分析计量，2010，19(2): 70-71.