离子排斥色谱法同时测定生物质液体燃料发酵液中的有机酸、糖、醇*

杨海燕，法芸

(中国科学院青岛生物能源与过程研究所，生物基材料重点实验室，山东青岛 266101 )

生物质能源具有存量丰富、环境友好、可再生等特点，作为能转化为液体燃料的可再生资源，正日益受到重视。利用富含木质纤维素的作物秸秆制备液体燃料的研究已经成为新的关注热点［1–5］。木质纤维素经过预处理后先转化为糖再进行发酵可生产乙醇，该体系成分复杂，而检测发酵体系中的混合糖及其代谢产物——有机酸及醇等，对考察木质纤维素水解液的利用情况、产醇效率及菌株代谢过程具有重要意义。

1991年Doyon［6］等首次报道了使用离子排斥色谱法结合示差和二极管阵列检测器同时分析食品中的有机酸，糖类和乙醇。离子排斥色谱法检测食品、环境样品中的糖、有机酸已有很多报道［7–12］。姜岷［13］、马瑞［14］等先后运用离子排斥色谱法分别检测了厌氧产丁二酸发酵液和米根霉乳酸发酵液中的有机酸和糖。袁文杰［15］等用相同方法同时分析了菊芋发酵液中的乙醇和有机酸。但国内用于生物能源领域液体燃料乙醇研究中的报道较少，分析发酵液体系的上述报道，均在小于55℃的柱温条件下进行，对于成分复杂的发酵液体系，仍存在组分共淋洗的干扰。

笔者采用离子排斥色谱柱Bio-Rad Aminex HPX–87H和示差折光检测器，在65℃的条件下实现了单糖、二糖、有机酸和醇的有效分离。建立了同时检测秸秆发酵液中的纤维二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甲酸、乙酸、丁酸及乙醇8种有机物的分析方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：Agilent1200型，配RID检测器、Agilent色谱工作站，美国安捷伦科技有限公司；

离心机：Sigma1–14型，最大转速14 800 r／min，德国Sigma公司；

电子天平：EL204–IC型，瑞士梅特勒–托利多公司；

超纯水机：Milli-Q Reference型，美国Millipore公司；

硫酸：分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司；

纤维二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甲酸、乙酸、丁酸、乙醇：糖为25 g／瓶、酸为10 mL／支，优级纯，美国Sigma公司。

1.2 色谱条件

离子排斥色谱柱：Bio-Rad Aminex HPX–87H型（300 mm×7.8 mm，9 μm）；保 护 柱：Cation-H Refill Cartridges型（30 mm ×4.6 mm）；流动相：5 mmol／L H2SO4溶液；流量：0.6 mL／min；柱温：65 ℃；检测器：RID；进样体积：10 μL。

1.3 标准曲线绘制

用超纯水分别配制8种标准物质的储备溶液，然后按比例稀释成一系列不同浓度的混合标准溶液（具体浓度见表1）。按1.2色谱条件进样分析，以色谱峰面积为纵坐标，以标准溶液的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

表1 混合标准溶液的质量浓度 mg／L

1.4 样品处理

取5 mL玉米秸秆发酵液，以6 000 r／min离心5 min，除去难溶性物质，取上层清液稀释10倍，然后用0.22 μm滤膜过滤即得待测液。

2 结果与讨论

2.1 柱温的选择

文 献［10，11，15］使 用Bio-Rad Aminex HPX–87H柱分析有机酸及糖、醇时所用柱温各不相同，为确认柱温对分析效果的影响，在色谱柱的耐温范围内考察了柱温45～65℃时的分离情况，结果如图1所示。从图1中可以看出柱温对葡萄糖和木糖、丁酸和乙醇的分离度都有影响，尤其是对丁酸和乙醇的分离度影响较大。60℃以下丁酸与乙醇的色谱峰重合，60℃时可以将两者分开，在65℃的条件下，丁酸与乙醇的分离效果最好，色谱峰形尖锐。因此选择最佳柱温条件为65℃。

图1 柱温对混合标准溶液中各组分保留时间的影响

2.2 线性方程和检出限

在1.2色谱条件下对按照表1所配制的一系列混合标准溶液进行测试，以色谱峰面积对溶液的质量浓度进行线性回归，得各被测物质的回归方程，以信噪比S／N=3计算检出限。线性范围、线性方程、相关系数和检出限见表2。由表2可知，8种标准品线性相关系数(r2)在0.999 0～0.999 99之间。

表2 线性范围、线性方程、相关系数和检测限

2.3 精密度和加标回收试验

取发酵液样品与表1中4#标准溶液等体积混合均匀，然后用0.22 μm滤膜过滤，按1.2色谱条件进样分析，重复6次，测定结果见表3。由表3可知，加标样品6次测定结果的相对标准偏差为0.27%～2.19%，平均回收率为97.47%～107.41%。加标样品色谱图如图2，图中可见8种组分之间及其与样品基质之间分离良好。

表3 样品加标回收试验结果(n=6)

图2 玉米秸秆发酵液样品和加标后发酵液样品的色谱图

2.4 样品分析

将秸秆发酵液样品按照1.4方法进行处理后测定，样品中各代谢组分均得到了基线分离，色谱峰形尖锐。各组分测定结果见表4。

表4 秸秆发酵液样品测定结果

3 结语

采用离子排斥色谱法实现了生物质发酵液中纤维二糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甲酸、乙酸、丁酸及乙醇8种有机物的同时分析。该方法简单快速、准确可靠，可应用于生物能源领域液体燃料乙醇的研究，适用于秸秆发酵液中多种糖类、有机酸、醇等化合物的分析。

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