济南小清河水样细菌的分离、分子鉴定及对污染河水的修复作用

岳寿松+边斐+邹晓凤+王翠萍+孙林波+田顺+孙凯+陈文娟

摘 要：从济南小清河水样中共获得不同菌落特征的细菌微生物13种，利用分子生物学方法对培养得到的菌株进行分子鉴定及系统发育分析，结果表明：13株微生物分属于8个属，分别为肠杆菌属（Enterobacter）、气单胞菌属（Aeromonas）、克雷伯氏菌属 （Klebsiella）、微杆菌属（Microbacterium）、希瓦氏菌属（Shewanella）、金黄杆菌属（Chryseobacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、枸橼酸杆菌属（Citrobacter）和寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）。研究了地衣芽孢杆菌QH11和嗜麦芽寡养（窄食）单胞菌QH13对水体化学需氧量（CODCr）和氨氮（NH3-N）的去除作用，结果表明，处理5天后，QH11对 CODCr和NH3-N的去除率分别为70.6%和84.8%， QH13的去除率分别为58.5%和52.3%。

关键词：小清河；细菌；分子鉴定；生物修复

中图分类号：S182：X522 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）11-0063-05

小清河发源于济南市，全长237 km，其中济南河段位于城区北部，是省城主城区唯一的防洪除涝和排污河道[1]。小清河为典型城市内河，已成为济南市城市生态系统重要的组成部分。近几十年来，随着城市化进程的不断加快，城市人口聚集，经济活动日趋频繁，工业废水和生活污水大量排放，河水污染逐渐加重，不但制约城市的社会、经济与环境可持续发展，同时危及人类身体健康。

河道水体是一个复杂的生态系统，微生物为生态系统中的重要组成部分。水体中的微生物种群分布与区域环境有着密切联系，在物质循环与能量流动中发挥着非常重要的作用[2～4]。河水污染产生的有害气味以及主要污染指标总氮（TH）和总磷（TP）含量等均与水体微生物的种群特点密切相关[5，6]。微生物对水体净化具有重要作用，水体污染的微生物修复技术越来越受重视。在污染水体中，微生物经过驯化后大量繁殖，通过其代谢作用将水体中有害的无机物、部分复杂的有机物分解为简单的、稳定的无毒物质，增强水体的自净能力[7～10]。与其他治污方法相比，微生物修复技术没有二次污染、效果稳定、持续时间长，有利于自然生态的恢复。根据不同水体特点筛选功能微生物，对提高污染修复的效率和效益具有重要意义。

本研究对济南小清河河水细菌进行分离培养，并利用16S rDNA序列分析进行鉴定与系统发育分析，筛选具有降低水体CODCr和氨氮含量的微生物，为济南小清河水质改善提供理论依据，同时为城市河道污染的原位修复提供基础。

1 材料与方法

1.1 样品采集及细菌分离纯化

水样采集于济南小清河还乡店位点。取样时间2013年6月19日，为雨季到来前的枯水期，河水水质较差。利用LB培养基分别对水样原液、10-1、10-2和10-3梯度稀释液平板涂布法培养，培养温度37℃，培养时间48 h。选取典型菌落，记录其形态特点，革兰氏染色观察菌株形态。纯化菌株进行分子鉴定和系统发育树分析。

1.2 细菌16S rDNA基因的克隆、测序

DNA提取、酶切、连接和转化等操作方法参照文献[11]。扩增引物上游P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游P2：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3′。PCR条件：95℃ 5 min；94℃ 40 s， 55℃ 40 s， 72℃ 2 min，30个循环；72℃ 10 min。PCR扩增产物经胶回收后克隆至pMD18-T载体，转化E. coli DH5α，将阳性克隆送北京博尚生物公司测序。

1.3 系统发育树构建

将16S rDNA序列与GenBank已知核酸序列进行BLAST分析。把与该序列同源性较高的已知菌株的16S rDNA基因序列，用ClustalX 1.83进行多序列比对，采用Neighbor-Joining方法，通过MEGA 5.10软件构建系统发育树。

1.4 细菌对污染河水的修复作用

1.4.1 试验菌种 地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）和嗜麦芽寡养（窄食）单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）均分离自小清河水样。液体培养繁殖，调节菌液浓度为108 cfu/mL，4℃冰箱储存备用。

1.4.2 菌株对河水CODCr、氨氮的去除作用 4 L反应器（直径15 cm）加入3.7 L小清河水样。按1‰量（V/V）加入各菌剂，对照不加菌剂。每天测定CODCr和氨氮含量。CODCr采用重酪酸钾法测定，氨氮采用纳氏比色法测定。

2 结果与分析

2.1 小清河水样细菌分离

利用LB培养基对小清河水样中的细菌进行分离与培养，从各梯度培养基共选取13种典型菌落，记录菌落形态特点，革兰氏染色观察菌株形态（表1）。

2.2 小清河水样细菌分子鉴定

利用引物P1/P2进行PCR扩增，获得菌株QH01～QH13的16S rDNA。PCR产物连接到pMD18-T质粒进行测序分析，得到每一菌株的16S rDNA序列全长，将序列提交至GenBank进行BLAST比对，结果见表2。

2.3 系统发育树构建

进一步利用生物软件ClustalX 1.83和MEGA 5.10、采用邻接法（neighbor-joining method）构建16S rDNA系统发育树，以自展分析 （bootstraping） 法评估发育树，去除置信度低于50%的分支。结果（图1）表明，菌株QH02、QH06和QH10亲缘关系较近，为气单胞菌属（Aeromonas）。其中QH02与嗜水气单胞菌A. hydrophila CECT-5745最近缘、QH06与豚鼠气单胞菌A. caviae P087最近缘、QH10 与A. caviae SCSB1最近缘。QH03与克雷伯氏菌聚在一群，且与Klebsiella sp. HE1最近缘。QH01与肠杆菌属Enterobacter聚为一族，与霍氏肠杆菌E. hormaechei ASU-001 近缘。QH12 与枸橼酸杆菌属（Citrobacter） 聚为一族，与弗氏枸橼酸杆菌C. freundii MRB070408-1最近缘。QH07与希瓦氏菌属（Shewanella）聚为一族，与腐败希瓦氏菌S. putrefaciens Hac334近缘。QH13 与寡养单胞菌（Stenotrophomonas）聚为一族，与嗜麦芽寡养（窄食）单胞菌S. maltophilia YSP48近缘。QH09和QH11与芽孢杆菌属（Bacillus）聚为一族，QH09与短小芽孢杆菌B. pumilus N0819 最近缘，QH11与地衣芽孢杆菌B. licheniformis KVR最近缘。QH04和QH05与微杆菌属（Microbacterium）聚为一族，QH04与微杆菌Microbacterium sp. Long-2最近缘，QH05与砖红色微杆菌M. testaceum IARI-BHI-3最近缘。QHO8与金黄杆菌属（Chryseobacterium）聚为一族，与C. taeanense ARB-2 最近缘。系统发育树分析结果与BLAST比对结果一致。endprint

2.4 不同菌株对污染河水的修复作用

2.4.1 不同菌株对河水CODCr的去除作用 研究了地衣芽孢杆菌QH11、短小芽孢杆菌QH09和嗜麦芽寡养（窄食）单胞菌QH13对水体CODCr含量的影响。加入菌剂2天后水体CODCr下降趋势明显，到第5天时，与对照相比，各处理的水体CODCr去除率分别为地衣芽孢杆菌70.6%、嗜麦芽寡养（窄食）单胞菌58.5%、短小芽孢杆菌48.5%（图2）。地衣芽孢杆菌和嗜麦芽寡养（窄食）单胞菌表现了明显的水体CODCr清除能力。

2.4.2 不同菌株对河水氨氮（NH3-N）的去除作用 不同菌株处理水体NH3-N含量变化趋势不同。各菌株对水体NH3-N均有去除作用。与对照相比，去除率分别为地衣芽孢杆菌84.8%、嗜麦芽寡养（窄食）单胞菌52.3%、短小芽孢杆菌39.4%（图3）。地衣芽孢杆菌和嗜麦芽寡养（窄食）单胞菌表现了较强的降低水体氨氮的能力。

济南小清河水样中分离鉴定的13株细菌微生物分属于8个属，分别为肠杆菌属（Enterobacter）、气单胞菌属（Aeromonas）、克雷伯氏菌属 （Klebsiella）、微杆菌属（Microbacterium）、希瓦氏菌属（Shewanella）、金黄杆菌属（Chryseobacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、枸橼酸杆菌属（Citrobacter）和寡养单胞菌属（Stenotrophomonas），表明小清河细菌微生物种群的多样性。这些细菌中既有常见菌，如各类气单胞菌和微杆菌等，也有条件致病菌如希瓦氏菌、弗氏枸橼酸杆菌和嗜麦芽寡养（窄食）单胞菌，特别是存在对人和动物健康有严重威胁的致病菌如克雷伯氏菌、金黄杆菌，因此在修复水环境、净化水质的同时，要进一步考虑对有害致病菌的防控。

本试验还研究了从河水中分离鉴定的地衣芽孢杆菌QH11、短小芽孢杆菌QH09和嗜麦芽寡养（窄食）单胞菌QH13对水污染重要指标CODCr和氨氮含量的去除能力。结果表明，地衣芽孢杆菌对CODCr和NH3-N的去除率分别为70.6%和84.8%，嗜麦芽寡养（窄食）单胞菌的去除率分别为58.5%和52.3%，短小芽孢杆菌的去除率分别为48.5%和39.4%。地衣芽孢杆菌QH11和嗜麦芽寡养（窄食）单胞菌QH13均表现出较强的去除污染水体CODCr和NH3-N的能力，对水体污染修复具有开发应用价值。芽孢杆菌是一类重要的益生菌资源，具有降解工业废水和有机污染物的作用[12～15]，关于芽孢杆菌对城市河水污染修复的报道较少。本研究表明，分离自小清河水中的地衣芽孢杆菌具有很强的去除污染水体CODCr和氨氮去除率的能力，短小芽孢杆菌对水质改良也具有一定作用。嗜麦芽寡养（窄食）单胞菌属条件致病菌，近年来发现有些菌株具有特异性降解羽毛等角蛋白质能力[16～18]和对水中重金属污染的吸附与去除能力[19]。本研究首次发现嗜麦芽寡养（窄食）单胞菌对水体CODCr和氨氮具有明显的去除作用。今后将继续开展地衣芽孢杆菌QH11和嗜麦芽寡养（窄食）单胞菌QH13对水质修复的作用机制研究，为利用微生物技术修复河水污染提供理论和技术基础。

参 考 文 献：

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