真核翻译起始因子4A研究进展与展望

周玉梅+祖从从+周建峰

摘 要：真核翻译起始因子4A （eIF4A）蛋白属于DEAD-box RNA解旋酶家族，具有RNA依赖的ATP酶活性和ATP依赖的RNA解旋酶活性。脊椎动物中已经鉴定出三种eIF4A：eIF4A1、eIF4A2和eIF4A3。除参与翻译起始，eIF4A家族成员在胚胎发育等多种生命过程中也发挥着重要的作用。虽然三种eIF4A在序列上高度相似，但它们的作用不尽相同。eIF4A成员作用的独特性和多样化通常由相互作用的结合蛋白来调节。本文将eIF4A家族成员的最新研究进展，特别是eIF4A成员各自独特的作用作一综述。

关键词：eIF4A；翻译起始；DEAD-box解旋酶；胚胎发育

中图分类号：S18：Q753 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）11-0143-05

真核翻译起始因子4A （eIF4A）属于DEAD-box RNA解旋酶家族，最先被发现为翻译必需因子，后来发现是eIF4F翻译起始复合体的一个组分，在eIF4F复合体中发挥RNA解旋酶活性。哺乳动物中存在三种eIF4A：eIF4A1、eIF4A2和eIF4A3。小鼠存在eIF4Al和eIF4A2，兔子只存在一种eIF4A，爪蟾中发现了全部三种eIF4A，酿酒酵母中发现了由Tif1和Tif2编码产生的同一种eIF4A，果蝇中发现了eIF4A1和eIF4A3。另外，在拟南芥、小麦等生物中也发现了相应的同源基因[1]。

eIF4A家族成员在序列上高度同源。人类eIF4A1和eIF4A2属于胞质蛋白，同源性高达90%，eIF4A3主要定位在核内，与eIF4A1的相似度稍低，约为60%。虽然eIF4A3序列与eIF4A1和eIF4A2相似，但功能却与eIF4A1和eIF4A2截然不同。eIF4A3与eIF4G的结合很弱，体外不能替代eIF4A1的解旋酶活性，其解旋酶活性也不能被eIF4B和eIF4H激活[1]。相反，eIF4A3与MAGOH-Y14的亲和力很高，三者结合后与MLN51（转移性淋巴结51）一起组成外显子连接复合体（exon junction complex， EJC）[2]。由于eIF4A1和eIF4A2在序列与结构上高度相似，并且体外试验证明两者在eIF4F复合体内可以自由交换[3]，因此长久以来两者的功能被认为是不可区分的，但是最近的研究表明两者的功能并不完全相同。有关eIF4A的综述国内尚未见报道，本文将从eIF4A的结构、蛋白调节以及生物学功能特别是各成员之间不同的作用等方面作一综述。

1 eIF4A蛋白的结构

eIF4A是DEAD-box蛋白家族的典型成员，是最小的DEAD-box蛋白，含有两个RecA样结构域和一个灵活的中间转轴区域，中间区域的灵活性保证eIF4A在打开和关闭两种构象间转换[4]。所有的DEAD-box家族蛋白都包含9个保守的基序：Q、Ⅰ、Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ（图1）[5]。eIF4A的基序Ⅰa、Ⅰb、Ⅳ、Ⅴ参与RNA的结合，基序Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ主要参与RNA依赖的ATP酶活性，基序Ⅵ对于RNA结合和ATP水解都是必需的[6]。酵母eIF4A的晶体结构已经被解析[7]。科学家们最近也已经获得了eIF4A家族成员与不同的蛋白分子结合形成的复合物结构：eIF4A-PDCD4（程序性细胞死亡因子4）、eIF4A-eIF4G、eIF4A-eIF4G-eIF4H和eIF4A3-MLN51-MAGOH（magonashi同系物）-Y14 [6]。

eIF4A存在打开和关闭两种构象，ATP的结合与水解导致eIF4A在这两种构象间转换[4]。ATP结合到eIF4A-eIF4G复合物上，导致eIF4A关闭，eIF4A关闭触发ATP水解，ATP水解后eIF4A又恢复开放构象，导致它与RNA的亲和力降低，与另一ATP分子的结合将再次触发关闭的构象。这种构象间的转换过程会一直持续到mRNA 5′UTR的二级结构打开[6]。需要指出的是，在DEAD-box RNA解旋酶打开mRNA二级结构的过程中是否需要ATP水解还有争议。

2 eIF4A蛋白的调节

在哺乳动物细胞中，绝大多数的eIF4A以自由形式存在，其余的eIF4A与帽结合蛋白eIF4E、脚手架蛋白eIF4G一起组成eIF4F复合体。尽管单独存在时，eIF4A的三个成员都可以在一定程度上解开dsRNA，但是它们的解旋酶活性很低。当eIF4A以eIF4F复合体的形式存在时，其RNA解旋酶活性能够被翻译起始因子eIF4B、eIF4H、eIF4E、eIF4G激活[5]。例如，当与eIF4G和eIF4B绑定时，RNA解旋酶和ATP酶的活性增加超过100倍[8]。eIF4A解旋酶活性的调节可能是为了保证解旋酶活性只有在eIF4A招募到特定的mRNA上之后才能被激活，有效防止没有被结合伴侣靶定的RNA的二级结构被打开[6]。基于无配体状态下eIF4A的结构特点，研究者们提出了一种理论：相互作用因子可能通过促进eIF4A关闭构象的形成与稳定来激活eIF4A的活性[7]。

除翻译起始因子外，肿瘤抑制蛋白PDCD4可以通过其C末端的两个MA3结构域与两分子eIF4A结合，阻止eIF4A与eIF4G结合，抑制eIF4A的活性和帽依赖性的翻译起始[9]。Patemine A是一种具有抗增殖和促凋亡活性的小分子，它可以通过其内部结构域连接区与eIF4A结合，增强eIF4A的ATP酶活性，同时抑制eIF4A与eIF4G结合[10]。此外，15d-PGJ2（15-脱氧-8 12，14-前列腺素 J2）也可以抑制eIF4A的活性[11]。

3 eIF4A的生物学功能

3.1 eIF4A1与eIF4A2结构类似但功能不同

脊椎动物eIF4A1和eIF4A2的序列与结构高度相似，长久以来两者的功能被认为是不可区分的。但是，随着研究的深入，越来越多的证据表明两者的作用不尽相同。在小鼠中两者的表达部位不同，eIF4A1在所有组织中表达，eIF4A2主要在具有低增殖活性的器官中表达。不同细胞状态下，两者的表达不同，eIF4A1在生长活跃的细胞中高表达，而eIF4A2在生长停滞的细胞中高表达[6]。感染口蹄疫病毒的哺乳动物细胞中eIF4A1会被切割，而eIF4A2不被切割[12]。甲基鸟苷帽子类似物的琼脂糖珠下拉试验中，eIF4A1比eIF4A2更多的被拉下来，这表明eIF4A1可能更优先结合到eIF4F复合体内[13]。与siRNA干扰eIF4A1不同，siRNA干扰eIF4A2不会减少甲硫氨酸进入以及改变多核蛋白体图谱中总体mRNA的分布。虽然eIF4A1敲降会引起eIF4A2大幅增加，甚至超过敲降前eIF4A1和eIF4A2的摩尔总和，但是eIF4A2的这种上调并不能弥补eIF4A1敲降引起的甲硫氨酸进入的减少，也不会改变多核蛋白体的图谱[13]。敲降eIF4A1抑制细胞生长，然而敲降eIF4A2不会有这种影响[13]。以上证据表明，在体内eIF4A1和eIF4A2的作用不是重叠的。endprint

最近研究发现，内源的eIF4A1和eIF4A2具有不同的结合蛋白[14]。eIF4A2与CCR4-NOT复合体的一个成员—cNOT7结合后在miRNA的调节中发挥重要作用。缺失eIF4A2能够减弱miRNA介导的翻译抑制，并且这种减弱效应不能被eIF4A1营救，表明miRNA抑制不是由eIF4A的总量减少引起的[14]。所有这些证据都说明eIF4A1和eIF4A2的作用不尽相同。

3.2 eIF4A3作用独特

虽然eIF4A3序列与eIF4A1和eIF4A2相似，但功能却与eIF4A1和eIF4A2截然不同。在细胞核内，eIF4A3与MAGOH-Y14结合后，与MLN51一起组成EJC复合体[2]。在哺乳动物细胞中EJC与剪接一起形成，在剪接连接点上游20～24个核苷酸处与新产生的mRNA紧密结合。紧密结合在mRNA上的EJC在各种后剪接事件，如mRNA出核、亚细胞定位、质量监测以及翻译等过程中发挥重要作用[2，15]。eIF4A3作为EJC的一个核心组分，可以直接与RNA结合。eIF4A3与MAGOH-Y14结合后抑制ATP水解，将eIF4A3锁定在一个关闭的构象，使得eIF4A3与单链RNA紧紧结合在一起。将MAGOH-Y14从eIF4A3上解离下来后，ATP迅速水解，eIF4A3恢复开放构象，释放RNA[16]。eIF4A3作为EJC的核心组分发挥作用的方式打破了DEAD-box RNA解旋酶的作用取决于其ATP酶和解旋酶活性的共识。事实上，正是因为eIF4A3的解旋酶活性很低，使得它能够作为RNA分子夹，参与EJC在mRNA上的定位[6]。除发挥EJC介导的各种生命过程外，研究者们还发现eIF4A3在哺乳动物硒蛋白合成、脊椎动物胚胎发育中发挥重要的作用。

3.2.1 eIF4A3在NMD中的作用 任何错误剪接、移码、插入等遗传失误都可能引入含有提前终止密码子（premature termination codons， PTC）的转录产物，如不及时清除将导致翻译提前终止，产生无功能甚至有毒害性的截短蛋白（truncated proteins）。真核生物能够通过无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay， NMD）将含有PTC的异常转录产物快速清除，防止截短蛋白的产生，是一种重要的mRNA监视机制[17]。

NMD的启动与多种调控元件有关。Ferraiuolo等研究发现，siRNA干扰eIF4A3会抑制NMD，但是干扰eIF4A1和eIF4A2不会抑制NMD；并且eIF4A3与mRNA的结合是剪接依赖性的[18]，揭示eIF4A3参与NMD途径，并且不能被eIF4A1和eIF4A2替代。Shibuya等进一步研究发现，eIF4A3能够与EJC的另外两个核心蛋白Y14和MAGOH相互作用，共同调节NMD途径[19]。Gehring等研究发现，eIF4A3、Y14、MAGOH以UPF2非依赖的方式激活NMD途径[20]。删除eIF4A3的N端严重削弱了NMD活性，而仅保留N端区域的eIF4A3突变体没有NMD活性，说明eIF4A3的N端区域对于NMD途径的激活是必要但不充分的。这是因为N末端对于eIF4A3与Y14-MAGOH异源二聚体的结合是必需的，删除N端破坏了eIF4A3与Y14-MAGOH的结合。而且，eIF4A3与Y14-MAGOH、BTZ同时结合能够稳定eIF4A3与BTZ的相互作用，删除eIF4A3的N端区域导致eIF4A3-Y14-MAGOH-UPF3b-BTZ复合物无法形成，进而抑制NMD活性[20]。

3.2.2 eIF4A3在硒蛋白合成调节中的作用 硒是一种对于人和动物体非常重要的微量元素，主要以硒蛋白的形式发挥作用。硒蛋白的合成需要mRNA 3′UTR区域的硒代半胱氨酸插入序列（selenocysteine insertion sequence， SECIS）的帮助。硒蛋白的SECIS分为两类：Ⅰ型SECIS和Ⅱ型SECIS。Ⅰ型SECIS含有相对大的顶端环，Ⅱ型SECIS含一个小的顶端突起。GPx1、MsrB1、Dio1、SelN属于Ⅰ型SECIS，GPX4、SelW、SelT、TrxR1属于Ⅱ型SECIS。哺乳动物硒蛋白的合成受硒含量的调控，硒缺乏时，必需硒蛋白的合成不受影响，而非必需硒蛋白的合成减少[21]。

Budiman等研究发现，eIF4A3参与哺乳动物硒蛋白的调节，在缺硒条件下，eIF4A3能够与非必需硒蛋白的SEICS结合，造成空间位阻，阻碍SECIS与SECIS结合蛋白-2（SBP2）的结合，从而阻止蛋白翻译[22]。在缺硒细胞（ -SE）中用siRNA干扰eIF4A3可以使GPx1的蛋白表达量增加，在富硒细胞（ +SE）中过表达eIF4A3可以使GPx1的蛋白表达量减少，两种情况下GPx1 mRNA水平不受影响，说明调节发生在转录后水平[22]。作为EJC的核心组分与mRNA结合时，eIF4A3是非序列依赖性的。与之相反，eIF4A3在硒蛋白的合成调节中是SEICS选择性的，能够与非必需硒蛋白（GPx1、MsrB1、Dio1、SelN）的SECIS结合，但是不能与持家硒蛋白（GPX4、SelW、SelT、TrxR1）的SECIS结合[22，23]。SECIS的内部茎环结构对于eIF4A3与SECIS的结合是必需的，但是单独的内部茎环并不能实现两者的高亲和力，SECIS核心区对于两者的结合则是非必需的[22]，而内部茎环结构和核心区对于SBP2与SECIS的结合都是必需的[24]，说明缺硒条件下eIF4A3与SBP2竞争性的结合SECIS，两者的结合位点有重叠，但是不完全相同。进一步的研究发现，SECIS的内部茎环、顶端茎环以及核心区3′上游尿苷对于eIF4A3-SECIS复合体的形成是必需的[23]。动力学研究表明，内部茎环帮助eIF4A3识别SECIS，顶端茎环和核心区的尿苷对于维持eIF4A3-SECIS复合体的稳定性至关重要[23]。基于以上试验，研究者们提出了一个两点结合模型：与其他DEAD-box蛋白家庭成员类似，eIF4A3由两端的两个结构域和中间的连接子构成哑铃形，两端的两个结构域分别与SECIS的内部茎环和顶端茎环结合[23]。endprint

3.2.3 eIF4A3在脊椎动物发育中的作用 脊椎动物的胚胎发育是一个极其复杂的生物学过程。eIF4A3作为多蛋白复合体EJC的组分，参与了很多RNA水平上的调节过程[25]。Haremaki等研究发现，EJC对于脊椎动物早期胚胎发生是必不可少的，敲降eIF4A3会导致非洲爪蟾全身瘫痪，伴随感觉神经元、色素细胞和心脏发育缺陷；敲降EJC其他核心组分也会出现相似的表型，表明EJC在早期胚胎发育中至关重要[26]。早期的研究发现，过表达eIF4A3会激活BMP信号通路[28]，但是敲降eIF4A3并未出现与BMP信号削弱相关的表型，暗示eIF4A3可能只在其表达区域调节BMP信号，这些区域包括神经板/神经管边界[26]。瘫痪可以由一系列原因引起，其中包括骨骼肌和/或者神经发育缺陷。敲降eIF4A3表现出感觉神经元缺陷，这可能是胚胎无法对触摸刺激作出响应的基础，但不太可能导致胚胎全身瘫痪[26]。对敲降eIF4A3导致非洲爪蟾全身瘫痪机制的进一步研究发现，eIF4A3可以通过调节Ryr的正确剪接来调节肌肉细胞的收缩[27]。钙离子诱导的肌浆网中钙离子的释放对于肌肉细胞的收缩十分重要，钙离子释放受阻会减弱对电刺激的反应。Ryr1是肌肉细胞中钙离子释放的重要调节因子，Ryr1作用受损会严重影响钙离子的释放。敲降eIF4A3会导致Ryr错误剪接，使Ryr无法发挥正常功能，影响钙离子从肌浆网中释放，导致肌肉纤维发育缺陷，在一定程度上导致了全身瘫痪[27]。敲降eIF4A3会抑制胚胎色素生成以及心脏受损[26]，但是敲降Ryr不会影响色素生成或者造成心脏缺陷，表明eIF4A3对胚胎发育的调节不仅仅是通过Ryr来实现的，可能还有多种蛋白或者信号通路参与其中[27]。

4 前景与展望

eIF4A在翻译起始和胚胎发育等多种生命过程中发挥复杂而又重要的功能，虽然前人的研究使我们对eIF4A有了一定的认识，但是仍有很多问题需要解决：①eIF4A的解旋酶活性很大程度上取决于它们的结合蛋白，与eIF4F复合物结合能够激活翻译起始，而与CCRT-NOT复合物结合能够抑制翻译。在生物体内这两种作用如何巧妙协调，以及在低等生物中eIF4A是否发挥双重作用需要进一步研究。②癌细胞中的翻译起始经常失控，在转化细胞和癌细胞中，包括eIF4A1在内的很多翻译起始因子的基因表达水平发生改变[29]，提示我们eIF4A1可能参与了肿瘤和癌症的发生，是抗癌治疗的潜在靶点。③研究eIF4A1和eIF4A2的不同功能是最近eIF4A研究的一个焦点。考虑到它们高达90%的相似度，阐述这两种蛋白被招募到不同蛋白复合物上的分子机制很关键。④最近研究发现，CWC22通过其MIF4G结构域与eIF4A3直接结合，参与剪接依赖性的EJC组装[30]，这个新发现为EJC附着与前体mRNA剪接之间的紧密耦合提供了一种新的理论，其具体分子机制还不清楚。⑤前人的研究发现eIF4A参与Dpp/BMP信号通路的调控[31]，并且eIF4A3对于爪蟾的发育十分重要，研究eIF4A在脊椎动物发育中的分子机制对于全面揭示eIF4A的生物学功能意义重大。

参 考 文 献：

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