小麦SnRK2.2基因克隆、表达载体构建及转化

2014-12-23张照贵李冰王佳佳张桂芝李斯深

山东农业科学 2014年11期

张照贵+李冰+王佳佳+张桂芝+李斯深

摘要：SnRK2基因家族成员参与蛋白质的磷酸化，在植物抵御非生物胁迫方面发挥重要的作用。本研究以水稻SAPK2基因序列为基础，通过RT-PCR技术克隆得到一个新的小麦SnRK2基因，命名为TaSnRK2.2，并提交到GenBank（登录号：KJ850253）。TaSnRK2.2基因全长4 118 bp，由9个外显子和8个内含子组成，包含一个1 026 bp的开放阅读框，编码341个氨基酸。SnRK2.2基因序列在禾本科植物中高度保守，TaSnRK2.2与水稻SAPK2以及玉米SnRK2.2亲缘关系较近。TaSnRK2.2基因编码的蛋白质分子量为38.64 kD，理论等电点为5.45，含有SnRK2基因家族典型的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶保守结构域和多处磷酸化位点。构建了TaSnRK2.2基因过表达载体，转化拟南芥，获得转基因植株，通过RT-PCR方法检测到TaSnRK2.2基因在拟南芥中稳定表达。

关键词：小麦；非生物胁迫；TaSnRK2.2；克隆；转基因

中图分类号：S512.1+Q785 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2014）11-0001-07 小麦是世界上最重要的粮食作物之一，全世界约有35%的人口以小麦为主食，在中国粮食消费总量中，小麦占43%以上。我国地理环境复杂，自然灾害多发，干旱、盐碱以及极端温度等环境因素严重影响小麦产量，威胁小麦粮食生产安全。植物在长期的进化过程中形成了一系列应对复杂多变环境、抵御逆境胁迫的调控机制，众多的调控和防御类基因构成了植物应答和抵御逆境胁迫的分子生物学基础[1～3]。

研究表明，蔗糖非发酵相关蛋白激酶（Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase， SnRK）参与蛋白质的磷酸化，在植物激素信号传导、抵御非生物胁迫和调节植物生长发育等方面发挥重要的作用[4～6]。根据序列相似性和结构域特点，高等植物SnRK基因家族被分为3个亚族：SnRK1、SnRK2、SnRK3[7]。SnRK1基因已经从不同的植物中分离和鉴定，其参与植物氮元素、蔗糖以及脂质的代谢、器官发育与衰老等过程[8～11]。SnRK3基因又称类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶（calcineurin B-like protein interacting protein kinase， CIPK）基因[12，13]，能够介导Ca2+信号的传递和提高植物的抗逆性[14～17]。SnRK2基因数目较少，编码植物特有的蛋白激酶，主要参与植物应对逆境胁迫、养分利用和生长发育等过程，到目前为止已经鉴定了10个家族成员，统一命名为SnRK2.1～SnRK2.10[18]。

在小麦中，多个SnRK2基因家族成员已经被克隆并进行了功能验证。PKABA1是第一个被克隆的SnRK2家族成员，可被水分胁迫和脱落酸（Abscisic acid， ABA）诱导表达[19，20]。TaSnRK2.3可被聚乙二醇（Polyethylene glycol， PEG）、ABA、NaCl以及冷胁迫诱导，转TaSnRK2.3基因的拟南芥植株失水率下降，光合作用增强，细胞内脯氨酸含量增加，提高了对干旱、盐渍以及冷害的耐受性[21]。转TaSnRK2.4基因拟南芥植株较对照增加了对干旱、盐分以及冷胁迫的抵抗能力，同时种子萌发延缓、初生根增长以及生物量增加，表明TaSnRK2.4在植物抗逆性和生长发育方面发挥作用[22]。转TaSnRK2.7基因的拟南芥同样增加了对多种逆境胁迫的抗性，但其活性不被ABA诱导，说明TaSnRK2.7参与非ABA信号转导通路[23]。转TaSnRK2.8基因的拟南芥除增强了对逆境抗性外，其可溶性糖含量降低，说明TaSnRK2.8在碳水化合物的代谢中发挥作用[24]。小麦W55a也属于SnRK2家族成员，该基因受干旱等非生物胁迫的诱导[25]。以上研究表明，小麦SnRK2基因在抵御非生物胁迫方面发挥重要作用，并且参与植物的生长发育和碳水化合物的代谢过程。

随着植物基因工程技术的发展，利用分子生物学方法克隆小麦抗逆相关基因，研究其生物学功能，探索植物抗旱分子机理是近来研究的热点。水稻SAPK2基因是植物SnRK基因家族成员之一，本研究利用水稻SAPK2基因通过同源克隆的方法得到一个新的小麦SnRK2基因家族成员——TaSnRK2.2，并构建该基因的植物过表达载体，转化拟南芥，为进一步研究该基因的功能及在逆境条件下的表达特征奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料小麦品种鲁麦21用于TaSnRK2.2基因cDNA及gDNA的克隆和序列分析。Columbia型拟南芥用于遗传转化。

1.1.2 菌株和载体大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1和克隆载体pEASY-T1购自北京全式金生物技术有限公司，农杆菌菌株GV3101和表达载体PBI121由本实验室保存。

1.1.3 酶、试剂盒及其他耗材 LA Taq酶、限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶以及dNTP购自宝生物工程（大连）有限公司。反转录试剂盒The RevertAidTM Premium First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司。RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司。普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。其它化学药品为国产分析纯。

1.1.4 引物和测序本试验所用PCR引物合成及DNA测序工作由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA、gDNA提取和第一链cDNA合成小麦总RNA提取步骤按照TRIzol试剂说明书进行。小麦gDNA的提取参照改良的CTAB法[26]进行。第一链cDNA的合成参照The RevertAidTM Premium First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行。

1.2.2 目的基因的克隆以水稻SAPK2基因（GenBank登录号：AB125303）的mRNA序列为探针搜索小麦EST数据库，选取与探针序列相似性高的小麦EST，经DNAMAN软件拼接组装成TaSnRK2.2的电子克隆序列。利用NCBI中ORF finder程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）进行开放阅读框（open reading frame， ORF）预测。用Primer Premier 5.0软件在ORF两侧设计引物Sn1，上游引物Sn1-F：5′-ATGGAGCGGTACGAGGTG-3′；下游引物Sn1-R：5′-CACGCCTGCTCGTCACAA-3′

利用Sn1引物对小麦cDNA和gDNA进行PCR扩增。PCR反应体系为20 μL：10×PCR buffer 2 μL，dNTPs（各2.5 mmol/L）1.6 μL，LA Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，Sn1-F（10 μmol/L）和Sn1-R（10 μmol/L）各1 μL，cDNA或gDNA 1 μL（100 ng），ddH2O 13.2 μL。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性35 s，56℃退火35 s，72℃延伸90 s，30个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。回收产物与pEASY-T1载体于25℃连接15 min，并转化Trans1-T1感受态细胞。转化产物均匀涂布在含100 mg/L氨苄青霉素（Ampicillin， Amp）的LB平板上，37℃条件下培养12～16 h。随机挑选菌斑，在含有100 mg/L Amp的LB液体培养基中震荡培养4～5 h，取1 μL菌液进行PCR检测。挑选阳性克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.2.3 基因的生物信息学分析运用DNAMAN软件对测序结果进行比对，确定基因结构，并与其他物种的序列进行相似性分析。利用ProtParam程序（http：//web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸序列的理化性质。利用NetPhos2.0 Server程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测蛋白序列中的磷酸化位点。利用MEGA 6.0软件进行序列比对和进化分析。功能区域和活性位点分析通过在线程序PROSITE（http：//expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html）进行。利用SOPMA（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）和Swiss-Model 程序（http：//swissmodel.expasy.org/）对蛋白质二级结构和高级结构进行分析。

1.2.4 表达载体的构建和农杆菌转化参照质粒小提试剂盒说明书的步骤，提取pEASY-T1-TaSnRK2.2和PBI121质粒。设计引物Sn2，上游引物Sn2-F：5′-TAGGATCCATGGAGCGGTACGAGGTG-3′（下划线标注的碱基代表BamH Ⅰ内切酶识别位点）；下游引物Sn2-R：5′-AT-GAATTCCACGCCTGCTCGTCACAA-3′（下划线标注的碱基代表EcoRⅠ内切酶识别位点）。利用Sn2引物对pEASY-T1-TaSnRK2.2质粒进行PCR扩增。PCR产物和PBI121质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收目的片段，用T4 DNA连接酶连接，构建CaMV 35S启动子驱动的正义35S∶ TaSnRK2.2过表达载体。

将构建好的表达载体转化大肠杆菌感受态细胞，经培养后提取质粒，采用冻融法转化农杆菌GV3101。将转化后的农杆菌菌液加到含有50 mg/L 利福平（Rifampicin， Rif）和50 mg/L卡那霉素（Kanamycin， Kan）的YEP固体培养基上，在28℃条件下培养2～3天。转化子长出后挑取单菌落于YEP液体培养基中继续培养，提取质粒进行酶切和测序验证。

1.2.5 拟南芥的侵染和转基因植株的鉴定将验证正确的农杆菌接种于含有50 mg/L Rif的YEP液体培养基中，28℃、200 r/min震荡培养至菌液浑浊。按照1∶ 100的体积比将菌液转接到50 mL含有50 mg/L Rif 的YEP液体培养基中继续培养至OD600为0.6。5 000 r/min离心10 min，倒掉上清液，用等体积含有5%蔗糖和0.02% Silwet L-77的侵染液重悬菌体，即可用于拟南芥的转化。采用花序浸染法转化拟南芥，侵染时将拟南芥平放，使花序浸到浸染液中约10 s左右，然后将拟南芥平放到培养箱中，黑暗培养24 h后正常培养。

将收获的拟南芥种子在超净台中用70%乙醇灭菌5 min，2.6%次氯酸钠消毒10 min，用灭菌水冲洗干净。将灭菌的种子铺到含有50 mg/L Kan的1/2 MS培养基上，4℃条件下春化2天。转移到正常条件下培养7天后，转化植株幼苗能够在含有Kan的培养基上正常生长，叶片呈绿色，非转化幼苗则会呈现黄化状态。将转基因幼苗移植到基质中培养，植株长成后提取RNA进行RT-PCR检测，引物为Sn3，上游序列Sn3-F：5′-GCGAGAATGAGGCTAGGTTC-3′；下游序列Sn3-R：5′-CGTCGTCTATGTCGTCCAG-3′。

2 结果与分析

2.1 TaSnRK2.2基因克隆

以水稻SAPK2基因为探针筛选小麦EST数据库，选取2条序列相似性高且相互重叠的EST片段，CJ785127和DR741853。利用DNAMAN软件拼接，得到长度为1 359 bp的电子克隆序列，预测包含一个长度为1 026 bp的ORF。在ORF两侧设计引物Sn1对小麦cDNA和gDNA进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳后显示大小约为1 000 bp和4 000 bp（图1）。

测序结果表明，TaSnRK2.2基因的cDNA全长1 038 bp，包含长度为1 026 bp的ORF，编码341个氨基酸，与预期结果基本一致。与cDNA相对应的gDNA序列全长（从ATG到TGA）4 118 bp，包含9个外显子和8个内含子（图2），基因结构与水稻、玉米以及拟南芥的SnRK2.2相同，并且不同物种外显子大小和序列保守性较内含子强。序列已提交至GenBank（登录号：KJ850253）。

2.2 TaSnRK2.2基因的生物信息学分析

TaSnRK2.2基因编码的蛋白质分子量为38.64 kD，理论等电点为5.45。PROSITE程序分析表明（图3A），蛋白序列中含有丝氨酸/苏氨酸基因家族典型的保守结构域（第4～260位的氨基酸）、ATP结合位点（第10～33位的氨基酸）和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点（第119～131位的氨基酸）。NetPhos2.0 Server程序分析蛋白序列中含有7处丝氨酸（Serine， Ser）、1处苏氨酸（Threonine， Thr）和5处酪氨酸（Tyrosine， Tyr）磷酸化位点（图3C）。运用SOPMA和Swiss-Model对TaSnRK2.2蛋白质序列的高级结构进行预测，TaSnRK2.2基因编码的蛋白质含有38.12%的α螺旋、37.2%的无规则卷曲、8.21%的β转角以及16.42%的扩展链，具有和SnRK2基因家族类似的蛋白质三级结构（图3B）。

TaSnRK2.2基因与水稻、玉米和拟南芥SnRK2.2基因核苷酸序列的相似性分别为87.23%、85.48%和60.24%，氨基酸序列的相似性分别为91.20%、89.44%和66.76%。将TaSnRK2.2与水稻、玉米、拟南芥SnRK2基因家族成员做聚类分析，结果表明，SnRK2基因分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个亚族，TaSnRK2.2属于Ⅱ亚族，与SAPK2和ZmSnRK2.2亲缘关系较近（图4）。

2.3 表达载体的构建和鉴定

用Sn2引物扩增质粒pEASY-T1-TaSnRK2.2，PCR产物与PBI121-GUS质粒（约14.7 kb）同时进行BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切（图5）。回收带有酶切位点的TaSnRK2.2片段（1 026 bp）和PBI121载体双酶切片段（约12.7 kb），经T4 DNA连接酶连接，构建由CaMV 35S启动子驱动的、正义35S∶ TaSnRK2.2过表达载体（图6）。将构建好的载体转化大肠杆菌感受态，培养后提取质粒，采用冻融法转化农杆菌菌株GV3101，酶切鉴定阳性克隆（图7）。

2.4 拟南芥的转化及RT-PCR检测

采用花序浸染法转化拟南芥，收获T1代转基因拟南芥的种子，经适当干燥并消毒后平铺在含有Kan的1/2 MS培养基上。PBI121载体带有Kan抗性基因，转基因拟南芥幼苗在含有 Kan的培养基上生长正常，而非转基因幼苗生长不正常，发生黄化（图8）。利用RT-PCR检测目标基因在T1代转基因植株中的表达情况，结果如图9，非转基因拟南芥植株中无TaSnRK2.2基因表达，而在转基因植株中检测到TaSnRK2.2基因的表达。

3 讨论与结论

蛋白质的可逆磷酸化由蛋白激酶和蛋白磷酸酶共同调控，广泛参与植物对逆境胁迫和病虫害刺激的应答、植物体内能量代谢和信号转导过程[27， 28]。大量的植物蛋白激酶已被分离和鉴定，许多蛋白激酶处于植物对逆境胁迫感知和响应的中心环节[29]。植物SnRK2属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，各成员以不同的调控方式参与多种逆境胁迫应答，在拟南芥、水稻、玉米、大豆、高粱、烟草等植物中已经进行了广泛的研究和报道[30～35]。在小麦中，克隆了6个SnRK2基因并进行了功能分析，其在小麦抵御逆境胁迫中发挥重要作用。

本研究通过同源克隆结合RT-PCR方法克隆得到一个新的小麦SnRK2基因——TaSnRK2.2。TaSnRK2.2基因由9个外显子和8个内含子组成，包含一个1 026 bp的ORF，编码341个氨基酸。序列比对和进化分析表明，SnRK2.2基因在禾本科植物中高度保守，TaSnRK2.2与水稻SAPK2以及玉米SnRK2.2亲缘关系较近。SAPK2和ZmSnRK2.2受NaCl和高渗胁迫诱导表达[29，36]，推测TaSnRK2.2可能具有相同的生物学功能。TaSnRK2.2编码蛋白质含有SnRK2基因家族典型的丝氨酸/苏氨酸保守结构域，具有ATP结合位点和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点，同时含有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点。由此推测，TaSnRK2.2基因可能参与蛋白质的磷酸化，介导信号转导，参与小麦应对渗透胁迫的反应。

为了研究TaSnRK2.2基因在逆境胁迫中的作用，构建了TaSnRK2.2基因的植物过表达载体，采用花序浸染法转化拟南芥，获得了转TaSnRK2.2基因的拟南芥植株。通过RT-PCR方法检测到TaSnRK2.2基因在拟南芥中稳定表达，为该基因进一步的功能分析奠定了基础，以期为小麦抗逆分子育种提供优良的候选基因资源。

参考文献：

[1] Bartels D， Sunkar R. Drought and salt tolerance in plants[J]. Critical Reviews in Plant Sciences， 2005， 24： 23-58.

[2] Ingram J， Bartels D. The molecular basis of dehydration tolerance in plants [J]. Annual Review of Plant Biology， 1996， 47： 377-403.

[3] Ramanjulu S， Bartels D. Drought and desiccation induced modulation of gene expression in plants [J]. Plant， Cell and Environment， 2002， 25： 141-151.

[4] Fujii H， Zhu J K. Osmotic stress signaling via protein kinases [J]. Cellular and Molecular Life Sciences， 2012， 69： 3165-3173.

[5] Kulik A， Wawer I， Krzywińska E， et al. SnRK2 protein kinases-key regulators of plant response to abiotic stresses [J]. OMICS： A Journal of Integrative Biology， 2011， 15： 859-872.

[6] Shukla V， Mattoo A K. Sucrose non-fermenting 1-related protein kinase 2 （SnRK2）： a family of protein kinases involved in hyperosmotic stress signaling [J]. Physiology and Molecular Biology of Plants， 2008， 14： 91-100.

[7] Hrabak E M， Chan C W， Gribskov M， et al. The Arabidopsis CDPK-SnRK superfamily of protein kinases [J]. Plant Physiology， 2003， 132： 666-680.

[8] Alderson A， Sabelli P A， Dickinson J R， et al. Complementation of snf1， a mutation affecting global regulation of carbon metabolism in yeast， by a plant protein kinase cDNA [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，1991，88：8602-8605.

[9] Halford N G， Hey S， Jhurreea D， et al. Metabolic signalling and carbon partitioning： role of Snf1-related （SnRK1） protein kinase [J]. Journal of Experimental Botany， 2003， 54： 467-475.

[10] Muranaka T， Banno H， Machida Y. Characterization of tobacco protein kinase NPK5， a homolog of Saccharomyces cerevisiae SNF1 that constitutively activates expression of the glucose-repressible SUC2 gene for a secreted invertase of S. cerevisiae [J]. Molecular and Cellular Biology， 1994， 14： 2958-2965.

[11] Purcell P C， Smith A M， Halford N G. Antisense expression of a sucrose non-fermenting-1-related protein kinase sequence in potato results in decreased expression of sucrose synthase in tubers and loss of sucrose-inducibility of sucrose synthase transcripts in leaves [J]. The Plant Journal， 1998， 14： 195-202.

[12] Kim K N， Cheong Y H， Gupta R， et al. Interaction specificity of Arabidopsis calcineurin B-like calcium sensors and their target kinases [J]. Plant Physiology， 2000， 124： 1844-1853.

[13] Shi J， Kim K N， Ritz O， et al. Novel protein kinases associated with calcineurin B-like calcium sensors in Arabidopsis [J]. The Plant Cell， 1999， 11： 2393-2405.

[14] Liu J， Zhu J K. A calcium sensor homolog required for plant salt tolerance [J]. Science， 1998， 280： 1943-1945.

[15] Qiu Q S， Guo Y， Dietrich M A， et al. Regulation of SOS1， a plasma membrane Na+/H+ exchanger in Arabidopsis thaliana， by SOS2 and SOS3 [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2002， 99： 8436-8441.

[16] Qiu Q S， Barkla B J， Vera-Estrella R， et al. Na+/H+ exchange activity in the plasma membrane of Arabidopsis [J]. Plant Physiology， 2003， 132： 1041-1052.

[17] Shi H， Ishitani M， Kim C， et al. The Arabidopsis thaliana salt tolerance gene SOS1 encodes a putative Na+/H+ antiporter [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2000， 97： 6896-6901.

[18] Hrabak E M， Chan C W， Gribskov M， et al. The Arabidopsis CDPK-SnRK superfamily of protein kinases [J]. Plant Physiology， 2003， 132： 666-680.

[19] Anderberg R J， Walker-Simmons M. Isolation of a wheat cDNA clone for an abscisic acid-inducible transcript with homology to protein kinases [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 1992， 89： 10183-10187.

[20] Holappa L D， Walker-Simmons M. The wheat abscisic acid-responsive protein kinase mRNA， PKABA1， is up-regulated by dehydration， cold temperature， and osmotic stress [J]. Plant Physiology， 1995， 108： 1203-1210.

[21] Tian S， Mao X， Zhang H， et al. Cloning and characterization of TaSnRK2.3， a novel SnRK2 gene in common wheat [J]. Journal of Experimental Botany， 2013， 64： 2063-2080.

[22] Mao X， Zhang H， Tian S， et al. TaSnRK2.4， an SNF1-type serine/threonine protein kinase of wheat （Triticum aestivum L.）， confers enhanced multistress tolerance in Arabidopsis [J]. Journal of Experimental Botany， 2010， 61： 683-696.

[23] Zhang H， Mao X， Jing R， et al. Characterization of common wheat （Triticum aestivum L.） TaSnRK2.7 gene involved in abiotic stress responses [J]. Journal of Experimental Botany， 2011， 62： 975-988.

[24] Zhang H， Mao X， Wang C， et al. Overexpression of a common wheat gene TaSnRK2.8 enhances tolerance to drought， salt and low temperature in Arabidopsis [J]. PLoS One， 2010， 5： e16041.

[25] Xu Z S， Liu L， Ni Z Y， et al. W55a encodes a novel protein kinase that is involved in multiple stress responses [J]. Journal of Integrative Plant Biology， 2009， 51： 58-66.

[26] Van der Beek J， Verkerk R， Zabel P， et al. Mapping strategy for resistance genes in tomato based on RFLPs between cultivars： Cf9 （resistance to Cladosporium fulvum） on chromosome 1 [J]. Theoretical and Applied Genetics， 1992， 84： 106-112.

[27] Cohen P. Review Lecture： Protein phosphorylation and hormone action [J]. Biological Sciences， 1988， 234： 115-144.

[28] Knight H. Calcium signaling during abiotic stress in plants [J]. International Review of Cytology， 1999， 195： 269-324.

[29] Kobayashi Y， Yamamoto S， Minami H， et al. Differential activation of the rice sucrose nonfermenting1-related protein kinase2 family by hyperosmotic stress and abscisic acid [J]. The Plant Cell， 2004， 16： 1163-1177.

[30] Boudsocq M， Barbier-Brygoo H， Laurière C. Identification of nine sucrose non-fermenting 1-related protein kinases2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana [J]. Journal of Biological Chemistry， 2004， 279： 41758-41766.

[31] Kelner A， Pkala I， Kaczanowski S， et al. Biochemical characterization of the tobacco 42-kD protein kinase activated by osmotic stress [J]. Plant Physiology， 2004， 136： 3255-3265.

[32] Kolukisaoglu ， Weinl S， Blazevic D， et al. Calcium sensors and their interacting protein kinases： genomics of the Arabidopsis and rice CBL-CIPK signaling networks [J]. Plant Physiology， 2004， 134： 43-58.

[33] Li L B， Zhang Y R， Liu K C， et al. Identification and bioinformatics analysis of SnRK2 and CIPK family genes in sorghum [J]. Agricultural Sciences in China， 2010， 9： 19-30.

[34] Xiang Y， Huang Y， Xiong L. Characterization of stress-responsive CIPK genes in rice for stress tolerance improvement [J]. Plant Physiology， 2007， 144： 1416-1428.

[35] Zou H， Zhang X， Zhao J， et al. Cloning and characterization of maize ZmSPK1， a homologue to nonfermenting1-related protein kinase2 [J]. African Journal of Biotechnology， 2006， 5： 490-496.

[36] Huai J， Wang M， He J， et al. Cloning and characterization of the SnRK2 gene family from Zea mays [J]. Plant Cell Reports， 2008， 27： 1861-1868. 山东农业科学 2014，46（11）：8～11，14

[31] Kelner A， Pkala I， Kaczanowski S， et al. Biochemical characterization of the tobacco 42-kD protein kinase activated by osmotic stress [J]. Plant Physiology， 2004， 136： 3255-3265.

[33] Li L B， Zhang Y R， Liu K C， et al. Identification and bioinformatics analysis of SnRK2 and CIPK family genes in sorghum [J]. Agricultural Sciences in China， 2010， 9： 19-30.

[34] Xiang Y， Huang Y， Xiong L. Characterization of stress-responsive CIPK genes in rice for stress tolerance improvement [J]. Plant Physiology， 2007， 144： 1416-1428.

[31] Kelner A， Pkala I， Kaczanowski S， et al. Biochemical characterization of the tobacco 42-kD protein kinase activated by osmotic stress [J]. Plant Physiology， 2004， 136： 3255-3265.

[33] Li L B， Zhang Y R， Liu K C， et al. Identification and bioinformatics analysis of SnRK2 and CIPK family genes in sorghum [J]. Agricultural Sciences in China， 2010， 9： 19-30.

[34] Xiang Y， Huang Y， Xiong L. Characterization of stress-responsive CIPK genes in rice for stress tolerance improvement [J]. Plant Physiology， 2007， 144： 1416-1428.