复合微生物发酵棉秆制备植物栽培基质的培养基优化

周安盛+杨苗+王常高+杜馨+林建国+蔡俊

摘要：利用固氮菌、酵母菌和高产纤维素酶的细菌，采用混菌固态发酵的方式，以制备的植物栽培基质中蛋白质的含量为衡量指标，对棉秆发酵培养基进行优化。结果表明，在最优培养基为棉秆4.7 g，椰树果壳粉0.3 g，蛋白胨0.8 g，酵母粉0.1 g，尿素1.72 g，磷酸氢二钾0.304 g，水35 mL时，制备的植物栽培基质蛋白质含量达到29.08%，与发酵前（19.80%）相比提高了9.28个百分点。

关键词：棉秆;复合微生物;蛋白质;发酵;优化

中文分类号：Q939.96        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2014）21-5241-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.050

Optimizing Medium of Preparing Plant Cultivation Matrix with Compound Microbial Fermentation of Cotton Stalk

ZHOU An-sheng， YANG Miao， WANG Chang-gao， DU Xin， LIN Jian-guo， CAI Jun

（Key Laboratory of Fermentation Engineering，Ministry of Education/Hubei Provincial Cooperative Innovation Center of Industrial Fermentation， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， China）

Abstract： Using azotobacter， yeasts and bacteria with high-yield cellulose， mixed solid-state fermentation， response surface methodology， the fermentation medium of preparing plant cultivation matrix was optimized. The results showed that the optimal fermentation medium was 4.7 g cotton stalk， coconut shell powder 0.3 g， peptone 0.8 g， yeast powder 0.1 g， urea 1.72 g， potassium hydrogen phosphate 0.304 g， and water 35 mL. Under the optimal medium， content of protein reached 29.08%， increasing by 9.28 compared with the content of protein （19.80%） before the fermentation.

Key words： cotton stalk; Compound microbial; protein; fermentation; optimization

我国是产棉大国，据统计2007年全国棉花种植面积达592万km2，棉花总产量达762.4万t[1]，棉花秸秆总产量约为3 000万t。棉花是新疆的支柱性产业之一，新疆棉花种植面积约占全国的1/3，棉秆资源相当丰富。目前，该地区棉秆除少量用于造纸、制板、建筑和饲料生产[2-4]等外，剩下的大部分直接还田、焚烧或者就地掩埋。造成以上现状主要是因为棉秆含丰富的韧皮纤维和大量的木质纤维素，木制化程度高，牲畜适口性差，消化率低，用一般技术处理难以达到饲用标准，较少用于饲料，因而多被废弃。尤其是在农村，广大种植户无法将棉秆作为有机肥直接还田，就将棉秆进行焚烧，产生大量的CO2等气体，给生态环境带来污染，造成资源的浪费。由于产棉区气候干燥，棉花秸秆密实，难以腐蚀，就地掩埋的棉秆不能及时变为肥料，会增加土壤的负担，使肥力下降[5]。

棉秆的处理在生产实践上具有重要意义，方法大致分为以下几类：生物发酵[6-8]、化学法、物理化学法。常见的用途有作为反刍动物的饲料[9，10]，制作养殖业中的发酵床，发酵棉秆还在农业和沼气生产等方面有一定应用[11]。近年来，有机生态型无土栽培已成为中国无土栽培发展的主要形式。有机基质因其理化性质稳定，供肥充足，来源广泛，成本低廉，被广大农民接受，因此对基质的需求量连年增加[12]。目前关于油菜、玉米、小麦等秸秆的研究报道较多[13，14]。前人对棉秆的基质配比进行了较多研究，如崔元玗等[15]研究了棉秆栽培番茄的最佳基质配方，王芳等[16]对双孢蘑菇的棉秆栽培配方进行了研究，但是对发酵棉秆制备无土栽培基质的培养工艺的研究鲜有报道。

本研究利用固氮菌、酵母菌和高产纤维素酶的细菌，采用混菌固态发酵的方式，以制备的植物基质中蛋白质的含量为衡量指标，对棉秆发酵培养基进行优化，为以棉秆作原料发酵制备植物栽培基质的工艺提供指导。

1  材料与方法

1.1  材料

固氮菌、啤酒酵母、热带假丝酵母、弗氏埃希氏菌，均由本实验室保藏。

棉秆、椰树果壳：由湖北省农业科学院经济作物研究所提供。棉秆经白腐菌预处理一个月，灭菌，烘干，粉碎至20～60目。椰树果壳经清洗，烘干，粉碎至20～60目。麸皮、大豆粉、玉米粉、大米粉均为市售。

1.2  培养基

1）斜面和种子培养基（种子培养基加琼脂2%）。固氮菌：甘露醇1%、磷酸二氢钾0.02%、硫酸镁0.02%、氯化钠0.02%、硫酸钙0.01%、碳酸钙 0.5%。酵母：葡萄糖2%、酵母膏1%、蛋白胨2%。细菌：蛋白胨0.5%、牛肉膏0.3%、氯化钠0.5%。

2）初始混菌固态发酵培养基：棉秆5 g、蛋白胨1 g、酵母粉0.3 g、氯化铵2 g、硫酸铵2 g、磷酸氢二钾1 g、硫酸镁0.2 g、水35 mL。

1.3  方法

1.3.1  蛋白质含量的测定  采用恒重法[16]去除待测试样的水分，冷却，研磨备用。准确称取均匀试样0.5 g，置于100 mL烧杯中，加25 mL水，煮沸加入100 g/L硫酸铜溶液10 mL，25 g/L氢氧化钠溶液10 mL，间歇性搅拌，放置1 h。定性滤纸抽滤，用60～80 ℃的热水洗涤沉淀3次，用10 g/L氯化钡溶液5滴和2 mol/L盐酸溶液1滴，检验滤液至不生成白色沉淀为止。将滤纸和沉淀一起在65 ℃条件下烘干至恒重。采用半微量凯氏定氮法测定蛋白质含量[16]。1.3.2  种子液的制备和固态发酵条件  将上述50 mL种子培养基分装于250 mL的三角瓶中，121 ℃，20 min灭菌，分别接入已活化的菌株，固氮菌于32 ℃，180 r/min，培养20 h;酵母于30 ℃，180 r/min，培养20 h;细菌于37 ℃，180 r/min，培养10 h，即可制得处于对数生长期中期的种子液。在发酵开始时，先接入固氮菌1.2 mL，24 h后接入两株酵母菌和细菌各0.6 mL，总计接种量3 mL。34 ℃静置培养96 h。

1.3.3  发酵培养基的优化  采用Plackett-Burman（PB）试验设计，对主辅料添加量、硫酸铵、尿素、磷酸氢二钾、硫酸镁5个因素进行显著性分析。每个因素根据初始发酵培养基的组分水平，分别选取高水平（+）和低水平（-）进行试验。PB试验的因素和水平见表1。PB试验相关设计、数据分析以及模型的建立均使用MinitabTM软件完成。最陡爬坡试验是根据PB试验结果，按照显著性因素的变化效应，进一步确定因素水平，为后续响应面选择合适的中心试验点。最陡爬坡试验的原点和变化步长见表2。

响应面（RSM）分析方法是利用合理的试验设计并通过试验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来确定最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。按照中心复合试验设计（CCD），选取PB试验得到的显著性因素进行研究，以蛋白质含量为衡量指标，进行响应面分析和预测，获得发酵培养基的最优组成。中心复合试验设计、响应面分析以及模型的建立和预测均使用Design-Expert v8.0.6.1软件完成。CCD试验设计中的因素和水平见表3。

2   结果与分析

2.1  Plackett-Burman（PB）试验结果

表4是Plackett-Burman（PB）试验的结果，根据对试验结果的方差分析和5个因素的标准化效应的Pareto图（图1）可以看出，硫酸铵、尿素和磷酸氢二钾均对发酵棉秆中蛋白质含量有显著性影响，P值分别为0.025、0和0.031，而主辅料和硫酸镁则为非显著性因素。因此，对硫酸铵、尿素和磷酸氢二钾进行最陡爬坡试验，对主辅料、硫酸镁、蛋白胨和酵母粉进行最低添加量试验。

2.2  最陡爬坡试验结果

根据Plackett-Burman（PB）试验结果，进行最陡爬坡试验，试验序和结果见表5。随着试验的进行，棉秆中蛋白质含量缓慢上升，在第五组试验时达到峰值，为26.957%。因此，尿素和磷酸氢二钾分别选取2 g和0.2 g作为CCD试验的中心点。

2.3  非显著因素最低添加量试验结果

棉秆蛋白质含量与非显著因素添加量的关系见图2。由图2可知，通过单因素试验，确定了主辅料添加量为4.7 g和0.3 g，其中辅料果壳粉的添加量为0.3 g，同时硫酸镁、蛋白胨和酵母粉的添加量为0、0.8、0.1 g。

2.4  中心复合设计试验和响应面分析

尿素和磷酸氢二钾两个显著性因素进行中心复合设计试验的运行序和结果见表6。对结果进行方差分析并进行二次二元回归拟合，得到方程为Y=28.773-0.331X1+0.676X2+0.013X1X2-0.576X12-0.324X22，该方程中Y为蛋白质含量（%）的预测值，X1和X2分别为尿素和磷酸氢二钾的编码值。此模型的F值为28.06，说明此模型是显著的。其中X1（P=0.009 5）、X2（P=0.000 2）、X12（P=0.000 7）和X22（P=0.014 3）呈显著性影响，同时X1 X2的P值为0.923 2，大于0.05，为不显著项。此方程的R2达到了0.937 1，说明此方程具有较好的拟合度。此方程的3D响应面图和等高线图见图3。采用脊岭分析（图4），预测通过发酵棉秆得到最高的蛋白质含量为29.168 7%，此时编码值X1、X2分别取-0.28和1.04，对应的尿素取1.72 g和0.304 g。

对上述发酵棉秆最优化培养基组分进行验证性试验，结果蛋白质含量的平均值为29.08%，与模型预测值基本一致，说明该模型的建立是合理的。

3  结论

综合上述试验结果，混菌固态发酵棉秆制备植物栽培基质的最优培养基的组分：棉秆4.7 g，椰树果壳粉0.3 g，蛋白胨0.8 g，酵母粉0.1 g，尿素1.72 g，磷酸氢二钾0.304 g，水35 mL。在优化的培养基条件下，蛋白质含量达到29.08%，与发酵前（19.80%）相比提高了9.28个百分点。

有关发酵农作物秸秆提高其基质粗蛋白质含量的研究已有较多报道，但大多是涉及霉菌和酵母菌或者白腐菌和酵母菌的混菌发酵过程。李海红等[18]将从牛胃中筛选出的菌株和假丝酵母共同发酵玉米秸秆，粗蛋白含量提高了13%左右。杨柳燕等[19]对水生植物发酵产物蛋白质含量进行了研究，最高粗蛋白含量达到了39.88%。潘锋等[20]用2株真菌、3株酵母与白地霉共培养发酵稻草，最终粗蛋白质含量达到了19.37%。以上研究是关于粗蛋白饲料方面的应用，而本试验研究了固氮菌、酵母菌和产纤维素酶细菌混菌固态发酵棉花秸秆制备植物栽培基质的培养基组分，以蛋白质含量为衡量指标，其中，利用产纤维素酶的细菌替代传统的霉菌和白腐菌，能够简化工艺，缩短发酵时间，提高效率，同时加入的固氮菌能够增加基质中氮的含量。本研究成果作为植物栽培基质的主料，在实际应用之前，还需要进行压缩比、吸水率等相关性质的研究，同时，添加其他植物栽培所需营养物质和生物胶的复配试验和放大试验等也需要进一步研究。

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（责任编辑  赵  娟）

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（责任编辑  赵  娟）