无选择标记的转基因家畜制备技术

魏庆信+毕延震+郑新民

摘要：选择标记基因（Selectablemarkergenes，SMGs）为目前应用体细胞核移植技术制备转基因家畜所必须。然而一旦完成筛选得到所需要的转化细胞或完成转基因动物的构建之后，SMGs就变成不需要的或多余的，而且这些带有标记基因的家畜还存在安全方面的隐患。因此，建立无选择标记的转基因家畜技术势在必行。目前能够采取的策略一是在筛选转化细胞或构建成功目的基因表达的家畜之后，删除SMGs;二是使用无筛选标记的转基因技术。综述了应用Cre/LoxP位点特异性重组系统删除SMGs的各种方法，以及应用锌指核酸酶（ZFNs）、TALEN和CRISPR/Cas9等新型基因编辑技术，基于受精卵显微注射的无筛选标记转基因技术的研究进展，分析对于制备无SMGs的转基因家畜而言后者的优势所在，旨在为转基因家畜研究提供参考。

关键词：转基因家畜;选择标记;基因删除

中图分类号：S185;Q789文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）21-5057-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.21.001

PreparingTransgenicLivestocksWithoutSelectableMarker

WEIQing-xin，BIYan-zhen，ZHENGXin-min

（HubeiAcademyofAgricultureScience/HubeiKeyLabofAnimalEmbryoandMolecularBreeding，Wuhan430064，China）

Abstract：Selectablemarkergenes（SMGs）arenecessaryforproducingtransgeniclivestockbytransferringnuclearofsomaticcellcurrently.SMGswillbecomeunnecessary，redundantorevenhiddendangerafterobtainingtransgeniccellsoranimal.Theestablishmentofmarker-freetransgeniclivestocksisimperative.Therearetwostrategiescurrently.Oneistoremovemarkerafterscreeningtransformedcellsorbuildinggenelivestocksexpressionsuccessfully.Anotherisusingnon-selectivemarkertransgenictechnology.MethodsaboutusingCre/LoxPsite-specificrecombinationsystemtoremoveSMGs，applyingnewgeneeditingtechnologiesincludingzincfingernuclease（ZFNs），TALENandCRISPR/Cas9，microinjectionwithmarkerfreetransgenictechnology，andtheadvantagesofbuildingtransgeniclivestockswithoutSMGswerereviewed.Itwillprovidereferenceforfutherstudyingthetransgeniclivestocks.

Keywords：transgeniclivestock;selectablemarker;generemove

先期的家畜转基因技术（如显微注射、精子介导和病毒感染等方法）是依靠分子生物学技术在个体水平或胚胎水平上进行筛选，因而不需要在转化载体中设置选择标记。但这些方法不仅效率低，而且外源基因是随机整合的，病毒感染法还存在载体安全隐患。体细胞核移植技术的出现，使家畜的转基因从随机整合发展到靶向修饰，规避了随机整合所带来的非预期效应和不确定性，能有效地实行外源基因的定位整合、基因敲除和其他定向的遗传修饰，成为目前制备转基因家畜的主流方法之一。然而这种方法需要对转化的细胞进行筛选，这就必须引进选择标记基因。

选择标记基因（Selectable marker genes， SMGs）可分为两类：一类是指其编码产物能够使转化的细胞具有对抗生素的抗性，在培养基中加入抗生素等选择试剂，非转化的细胞死亡或生长受到抑制，而转化的细胞能够继续存活，从而将转化的细胞从大量的细胞中筛选出来的一类基因。构建转基因动物常用的这类标记基因有 kan（卡那霉素）、amp（氨苄青霉素）、neo（氨基糖苷磷酸转移酶基因）、tk（胸腺嘧啶激酶基因）等。另一类也称报告基因（Reporter gene），是指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入受体细胞、组织或器官，并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。目前转基因动物常用的报告基因是GFP（绿色荧光蛋白基因），由GFP衍生出来的还有BFP（蓝色荧光蛋白基因）、YFP（黄色荧光蛋白基因）等各种可视光的荧光蛋白基因。一旦完成筛选得到所需要的转化细胞或完成转基因动物的构建之后，SMGs就变成不需要的和多余的[1]，而且这些带有标记基因的动物还存在安全方面的隐患：①当人们食用了转基因动物的产品，SMGs编码蛋白有可能被转移到人体的细胞或肠道微生物中，从而可能会降低抗生素在临床治疗中的有效性;②SMGs编码蛋白是否会成为新的致敏原，尚不得而知;③报告基因的存在会让消费者产生一种心理排斥反应;④有研究表明，绿色荧光蛋白转基因小鼠与对照组比较，体重和摄食量明显降低，部分脏器（肝脏、胸腺）发育不良，不排除外源GFP基因对动物发育存在一定毒性[2]。

因此，为了消除SMGs的安全隐患，建立无选择标记的转基因家畜制备技术势在必行。目前能够采取的策略：一是在筛选转化细胞或构建成功目的基因表达的动物之后，删除选择标记基因;二是使用无筛选标记的转基因技术。

1  SMGs的删除技术

目前用于转基因生物删除选择标记基因的方法主要有：共转化法、转座子法、位点特异性重组法和染色体内同源重组法。而应用于转基因家畜删除SMGs的，主要是位点特异性重组技术体系。

位点特异性重组技术是通过对特定序列进行准确切割和重新连接，从而对生物进行遗传改造的一种技术，是利用重组酶催化特异的重组位点间发生重组，导致重组位点间相互交换的一种精确重组形式。来源于微生物的位点特异性重组酶系统是一类很好的删除SMGs的工具。位点特异性重组系统包含两个部分：重组酶（Recombinase）和该重组酶能特异识别的位点（Recognition site）。重组酶是源于细菌或酵母可识别特异位点发生精确重组的一类酶。根据序列的同源性及催化氨基酸的特性，重组酶可分为酪氨酸和丝氨酸两个家族。目前已使用的重组系统包括：FLP/FRT、Cre/LoxP、R/RS及不可逆重组系统等，能够在动、植物中发生重组反应的主要是前3类，其中Cre/LoxP在转基因动物中研究得较为深入和广泛。

Cre/LoxP位点特异性重组系统是Sternberg等[3]首先在大肠杆菌噬菌体p1中发现的，由Cre重组酶和LoxP位点两部分组成。Cre重组酶是噬菌体pl编码的分子质量为38.5 kD的蛋白质，有1 029个核苷酸序列编码，能识别并催化LoxP位点的分子内和分子间的特异性重组。根据LoxP位点的排列形式，会产生3种重组结果：如果2个LoxP位点位于一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶能有效切除2个LoxP位点间的序列[4];如果2个LoxP位点位于一条DNA链上但方向相反，Cre重组酶能导致2个LoxP位点间的序列倒位[5];如果2个LoxP位点分别位于2条不同的DNA链或染色体上，Cre酶能介导2条DNA链的交换或染色体易位[6]。

利用Cre/LoxP系统删除SMGs有3种方式：质粒转染，蛋白转导以及在分别构建转Cre和转LoxP动物的基础上，通过杂交的方法删除SMGs。

1.1  Cre酶的质粒转染

质粒转染是指用Cre酶的重组表达质粒转染动物细胞，利用Cre酶的表达，切除LoxP位点锚定的SMGs。质粒转染的时机，可在核移植前进行，对动物细胞实行二次转化，切除细胞中的SMGs，然后再核移植，获得无SMGs的转基因动物;也可在获得转基因动物之后，对转基因动物的细胞进行转染，切除细胞中的SMGs，然后应用无SMGs的细胞进行核移植，从而获得无SMGs的转基因动物。

王志蕊等[7]将含有LoxP位点锚定的选择标记表达框（LoxP-CMV-NeoR-IRES-EGFP-Lox） 的ΔMSTN打靶载体，用电穿孔技术导入猪肾PK15细胞，经G418筛选，获得稳定整合该载体、EGFP表达均一的单克隆细胞系;然后将重组酶表达质粒pTurbo-Cre导入该细胞系，借助流式分选（FACS）、终点PCR、荧光定量PCR、TA克隆与测序等手段，证明Cre/LoxP重组系统可在猪细胞内高效介导内源性选择标记基因的删除反应，EGFP水平的删除效率达到46.1%，DNA水平的删除效率达到97.0%。然而猪肾PK15细胞毕竟是一种模型细胞，不能用于核移植生产克隆动物。上述技术体系尚需用分离的体细胞，如成纤维细胞等，观察二次转化之后细胞的生长态势。兰翀等[8]利用pBS185瞬间表达法删除首次转基因克隆内的标记基因，但因细胞老化严重，最终未获得可供检测用的单克隆细胞。表明用对体细胞进行二次转化的方法删除SMGs，存在细胞老化的风险。

在成功构建转基因动物之后，利用Cre酶的质粒转染转基因动物的体细胞，可以规避细胞老化的风险，有效地删除SMGs。Kuroiwa等[9]将Cre瞬时表达质粒转染转基因牛的成纤维细胞，筛选出无SMGs的细胞用于核移植，最终获得了无SMGs的免疫球蛋白μ链和PRNP双基因敲除的牛。Wang等[10]应用PBS185质粒转染转基因牛成纤维细胞，通过Cre酶的瞬时表达，有80%的细胞内SMGs被删除。然而应用这种方法最终获得无SMGs的转基因家畜，试验周期长，成本高。

为了缩短试验周期并防止二次转化所引起的细胞老化，可采取细胞拯救技术[11]。所谓细胞拯救，即是在第一次转化之后，用第一次转化的细胞作核供体进行核移植，获得重构胚;重构胚移植到代孕母畜后，取怀孕母畜的胎儿成纤维细胞（对猪而言，取怀孕35日龄的胎儿成纤维细胞）用Cre酶的质粒进行第二次转染，删除SMGs，再以删除SMGs的转基因细胞进行核移植，从而获得无SMGs的转基因家畜。

1.2  Cre酶的蛋白转导

蛋白转导可以高效地将有活性的蛋白直接转入动物细胞中，其原理是通过重组的方法改变目的蛋白的生物特性，尤其是加入与细胞渗透性有关的蛋白结构域，即所谓的蛋白转导结构域（Protein transduction domains， PTDs），如TAT（反式激活蛋白，来源于人类免疫缺陷病毒HIV，由11个氨基酸组成）、FGF（疏水多肽）、NLS（核定位序列）等。Cre/LoxP重组系统通过蛋白转导删除SMGs，在动物中常用的是TAT-Cre。

许媛媛[12]将纯化的TAT-Cre与转入溶菌酶基因山羊的耳成纤维细胞共孵育，通过培养、挑克隆、G418敏感性试验、PCR及Southern鉴定，最终获得抗性基因删除，保留了人溶菌酶基因表达框的单细胞克隆，抗性基因的删除效率为42%。兰翀等[8]利用TAT-Cre处理已经过一次转化的山羊成纤维细胞系，尽管删除SMGs的效率可达到43.9%，但这一过程经历了连续两次低密度传代和单细胞克隆的挑取，所获得的单细胞克隆严重老化，无法进一步传代，最终未获得可供克隆用的单克隆细胞;而他们用TAT-Cre酶处理人溶菌酶转基因山羊的耳成纤维细胞，成功删除了SMGs，其删除效率达72.8%。Yu等[13]在完成第一次修饰的基础上，通过转导TAT-Cre蛋白，获得了无抗性标记的转基因成纤维细胞，继而通过核移植得到了转基因克隆牛;令人欣喜的是他们通过一次遗传转化和一次蛋白转导，并没有造成细胞的老化，只是仍然残留报告基因EGFP，修饰并不彻底。

1.3  通过杂交的方法删除SMGs

通过杂交的方法获得无SMGs的转基因家畜，需要经过3个步骤：Cre转基因家畜的构建;LoxP转基因家畜的构建;两种家畜交配产生无SMGs的转基因家畜。子代家畜可以在体内表达Cre重组酶，从而将基因组内的两个LoxP位点间的序列切除。Carlson等[14]通过LoxP-SM-APOBEC3G转基因猪与PGK-YFP-Cre转基因猪交配，获得了无SMGs的子代猪。

用这种杂交的方法删除SMGs，试验周期更长，成本更高，因而少有人采用。

2  无筛选标记的转基因技术

使用无筛选标记的转基因技术对于防范SMGs的安全风险，显然是最好的选择。然而这种技术要求具备以下2项基本条件：①转化效率高。由于有高的转化效率，就可以通过受精卵的显微注射，在胚胎水平或个体水平上筛选遗传转化的胚胎或动物。②能精确地实行靶向修饰（或定位整合）。近几年出现的基因编辑技术，如锌指核酸酶（ZFNs）技术、TALEN技术和CRISPR/Cas9技术，不仅能实现精确的靶向修饰，而且转化效率高，满足了上述2项基本要求，为制备无筛选标记的转基因家畜提供了可行的技术路线。

ZFNs是高效的动物基因组位点特异性修饰酶，能够诱导生物体内的DNA在特定位置产生双链断裂，形成“双链断裂缺口”（Double strand break，DSB）。DSB可启动细胞内的DNA损伤修复机制，从而实现靶向基因敲除或敲入。Geurts等[15]最先应用ZFNs的DNA和mRNA进行胚胎显微注射，获得遗传修饰动物，他们将编码ZFNs的DNA质粒和mRNA分别显微注射到大鼠原核期的原核或胞质中，得到免疫球蛋白M基因（Immunoglobulin M，IgM）和Rab38基因敲除的大鼠。分析Geurts等人的试验结果，质粒原核注射共移植胚胎1 384枚，获得基因敲除动物18只，其效率为1.3%;mRNA原核注射共移植胚胎389枚，获得基因敲除动物59只，其效率为15.2%;mRNA胞质内注射共移植胚胎414枚，获得基因敲除动物38只，其效率为9.2%。Meyer等[16]针对小鼠Rosa26基因设计了1对ZFN，并且将构建的潮霉素基因同源打靶载体、β-半乳糖苷酶及Venus同源打靶载体，分别和ZFN的mRNA共同注射小鼠原核胚胎，产生转基因小鼠，同源打靶效率为1.7%～4.5%。Lillico等[17]将 ZFN的mRNA显微注射猪的受精卵，在得到的9头仔猪中，有一头实现了基因编辑。

TALEN效应蛋白（Transcription activation-like effector nucleases，转录样激活因子蛋白）是一种比ZFNs更容易设计、特异性更高的人工核酸内切酶。其原理类似于ZFNs，即可在识别特定DNA序列的基础上引入切割，造成双链断裂（Double-strand break， DSB），从而实现基因敲除和敲入[18，19]。利用TALEN技术，通过受精卵显微注射的途径对动物进行基因编辑，国内外已有多篇报道。例如：Anegon实验室利用TALEN技术，采用胚胎注射的方法使大鼠的IgM基因产生突变[20]。周芳芳等[21]将TALEN mRNA显微注射到受精卵内，在得到的45只仔鼠中，有6只在MSTN基因靶标位置发生了突变，基因编辑的效率为13.3%。Carlson等[22]将TALEN mRNA显微注射到牛和猪胚胎的胞质内，有75%的胚胎实现了基因编辑。Lillico等[17]将TALEN mRNA显微注射到猪的受精卵，在得到的39头仔猪中，有8头实现了基因编辑。

CRISPR/Cas9是一种全新的人工核酸内切酶，Cong等[23]首次报道，利用CRISPR/Cas9系统对人293T 细胞的EMX1和PVALB基因以及小鼠Nero2A细胞的Th基因实现了定点突变。之后的短短一年多时间，该系统被成功地应用于各种动物的基因编辑。相对于ZFNs和TALEN，CRISPR/Cas9系统具有突变效率更高、更精确、制作简单及成本低的特点。世界上第一个研究转基因动物的Wang等[24]将Cas9、Tet1和Tet2特异性的sgRNA注射到小鼠受精卵中，以高达80%的效率成功地在4个位点敲除了这2个基因，得到了双基因敲除的纯合子小鼠。这种基于受精卵注射的CRISPR/Cas9技术被称为“一步法”。Li等[25]在将CRISPR/Cas系统导入小鼠受精卵删除大片段DNA时，其试验的结果RNA注射比DNA注射更有效。欣喜的是，这种基于受精卵注射的CRISPR/Cas9技术（一步法）很快被成功地应用于家畜的基因修饰中。Hai等[26]应用CRISPR/CAS系统的一步法，获得了vWF基因敲除猪。

由于ZFNs、TALEN和CRISPR/Cas9技术的高效性和精确的靶向性，可以直接采用受精卵的显微注射技术制备转基因家畜，从而避开标记基因的使用。

对于制备无SMGs的转基因家畜而言，使用无标记基因的转基因技术，相对于先引入SMGs，而后再将其删除的复杂技术体系，具有显而易见的优势：①基因操作简便，只需构建一次基因打靶载体，且无需引入标记基因。②胚胎操作简便，只需应用受精卵的显微注射技术，即可一步到位，从而规避了克隆技术的操作复杂、效率低下和重编程不完全所引发的一系列问题。由此，近些年有些被冷落的受精卵显微注射技术，将作为一种制备转基因家畜的主流技术重新受到青睐。

参考文献：

[1] KALAJZIC Z， LI H T， WANG L P， et al. Use of an alpha-smooth muscle actin （SMAA） GFP reporter to identify an osteoprogenitor population[J]. Bone， 2008，43（3）：501-510.

[2] 贺晓玉，何  君，徐艳峰，等.绿色荧光蛋白转基因小鼠的生理生化常数[J].中国实验动物学报，2011，19（2）：145-149.

[3] STERNBERG N， SAUER B， HOESS R， et al. Bacteriophage P1 cre gene and its regulatory region. Evidence for multiple promoters and for regulation by DNA methylation[J]. J Mol Biol， 1986，187（2）：197-212.

[4] DEURSEN J V， FORNEROD M， REES B V， et al. Cre-mediated site-specific translocation between nonhomologous mouse chromosomes[J]. Proc Natl Acad Sci， 1995，92（16）：7376-7380.

[5] SWOBODA P， GAL S， HOHN B， et al. Intrachromosomal homologous recombination in whole plants[J]. EMBO J， 1994，13（2）：484-489.

[6] STUURMAN J， DE VROOMEN M J， NIJKAMP H J J， et al. Single-site manipulation of tomato chromosomes in vitro and in vivo using Cre-lox site-specific recombination[J]. Plant Mol Biol， 1996，32（5）：901-913.

[7] 王志蕊，刘西梅，周荆荣，等.Cre/LoxP重组系统删除内源性选择标记基因的效能评价[J].中国生物化学与分子生物学报，2014，30（1）：85-92.

[8] 兰  翀，任丽娜，吴  敏，等.利用Cre/LoxP系统删除转基因山羊体内的选择标记基因[J].生物工程学报，2013，29（12）：1847-1854.

[9] KUROIWA Y， KASINATHAN P， MATSUSHITA H， et al. Sequential targeting of the genes encoding immunoglobulin-mu and prion protein in cattle[J]. Nat Genet， 2004，36（7）：775-780.

[10] WANG S， SUN X， DING F， et al. Removal of selectable marker gene from fibroblast cells in transgenic cloned cattle by transient expression of Cre recombinase and subsequent effects on recloned embryo development[J]. Theriogenology， 2009，72（4）：535-541.

[11] 魏庆信，郑新民.转基因猪制备技术[M].北京：中国农业出版社，2004.271-273.

[12] 许媛媛.人溶菌酶转基因山羊中抗性基因删除的研究[D].济南：山东师范大学，2007.

[13] YU Y， WANG Y S， TONG Q， et al. A site-specific recombinase-based method to produce antibiotic selectable marker free transgenic cattle[J]. PLoS One， 2013，8（5）：e62457.

[14] CARLSON D F， GARBE J R， TAN W F， et al. Strategies for selection marker-free swine transgenesis using the Sleeping beauty transposon system[J]. Transgenic Res， 2011，20（5）：1125-1137.

[15] GEURTS A M， COST G J， FREYVERT Y， et a1. Knockout rats via embryo microinjection of Zinc-finger nucleases[J]. Science， 2009，325（5939）：433.

[16] MEYER M， DE ANGELIS M H， WURST W， et al. Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases[J]. PNAS， 2010，107（34）：15022-15026.

[17] LILLICO S G， PROUDFOOT C， CARISON D F， et al. Live pigs produced from genome edited zygotes[J]. Scientific Reports， 2013，3：1-4.

[18] BOCH J， SCHOLZE H， SCHORNACK S， et al. Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors[J]. Science， 2009，326（5959）：1509-1512.

[19] MOSCOU M J， BOGDANOVE A J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors[J]. Science， 2009，326（5959）：1501-1505.

[20] TESSON L， USAL C， M？魪NORET S， et al. Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs[J]. Nat Biotechnol， 2011，29（8）：695-696.

[21] 周芳芳，姜  坤，林玥琳，等.利用TALEN系统快速构建MSTN突变小鼠模型[A].中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会论文摘要汇编[C].北京：中国遗传学会，2013.

[22] CARLSON D F， TAN W F， LILLICO S G， et al. Efficient TALEN-mediated gene knockout in livestock[J]. Proc Natl Acad Sci， 2012，109（43）：17382-17387.

[23] CONG L， RAN F A， COX D， et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science， 2013，339（6121）：819-823.

[24] WANG H， YANG H， SHIVALILA C S， et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J]. Cell， 2013，153（4）：910-918.

[25] LI D， QIU Z， SHAO Y， et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system[J]. Nature Biotechnology， 2013，31（8）：681-683.

[26] HAI T， TENG F， GUO R F， et al. One-step generation of knockout pigs by zygote injection of CRISPR/Cas system[J]. Cell Research， 2014，24：372-375.