不同温度生理盐水对采集乳腺肿瘤标本的影响

童琛晔 冯原 蒋冰莹 查黎萍 唐艳红

（上海交通大学医学院附属瑞金医院手术室，上海200025）

为了建立符合我国经济发展水平的生物样本库，促进生物样本库建设过程中的有益知识和技术方法的传播，我院手术室联合乳腺疾病诊治中心于2012年起开始研究并构建上海及周边地区早期乳腺癌生物样本库，用以完善乳腺癌相关临床及基础研究的进行。我们参照2011年“中国医药生物技术协会生物样本库标准（试行）”（以下简称“标准”），并结合自身的特点，制定了一套符合我们医院的乳腺肿瘤生物样本采集、保存的标准化流程（SOP）。我们探讨不同温度的无菌生理盐水对采集乳腺肿瘤组织标本的影响，建立更加规范的生物样本采集、保存的SOP。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年10～12月乳腺癌肿瘤直径≥2.5cm的组织标本60例，由经过培训的专人负责采集标本。

1.2 材料准备 上海长征富民金山制药公司生产的长富牌无菌生理盐水，500ml装，玻璃瓶；洁定（GETINGE）公司加温暖箱；三菱公司家用冰箱；海尔公司超低温保存箱；灭菌温度计；经过处理的无RNA酶的刀片、眼科剪和尺、镊子等；手套，口罩等标准保护器材；其他材料：记号笔，标签，冻存管，采集标本的操作台等。

1.3 采样方法 每次取样前分别取无菌生理盐水3瓶放于洁净手术室室温（22～26℃）、三菱公司冰箱冷藏室（4℃）、洁定公司加温暖箱中（40℃），取材前准备好标有病例姓名缩写、住院号、肿瘤组织部位（T）、无菌生理盐水漂洗液的温度（C1、C2、C3）标签的冻存管。待标本离体后，采集专员取出3瓶无菌生理盐水并打开，用灭菌温度计分别测试3瓶生理盐水的温度，4～8℃的无菌生理盐水标记为C1，22～26℃的无菌生理盐水标记为C2，37～41℃的无菌生理盐水标记为C3。在标本离体后的30min内，更换器具切取肿瘤组织标本的1／5，0.5cm×0.5cm×0.5cm，并平均分成3份，分别用C1、C2、C3的生理盐水漂洗两次以洗去血液与污渍，再分别装入已编号的冻存管中，旋紧盖子后放入-80°超低温冰箱保存。于24h内由专职人员将冻存管转移至实验室由专职实验人员进行标本的总RNA提取鉴定。

1.4 鉴定标准 用紫外分光光度计对RNA样品进行量测，若吸光度ODZ60／OD280＞1.6，再用1%的琼脂糖凝胶电泳后，可见明显的28s和18s条带，若28s亮度比18s要高1～2倍，则表明RNA标本保存完好[2]。

1.5 统计学方法 采用SPSS 11.5建立数据库，采用统计描述、χ2分析等方法进行统计学分析。P＜0.05为差异有显著意义。

2 结果（表1）

表1 不同温度生理盐水与肿瘤标本质量情况比较 （例）

表1提示，三组标本RNA保存质量有显著性差异（P＜0.01），使用C1漂洗过的标本RNA保存质量最高。

3 讨论

3.1 生理盐水在采集乳腺肿瘤组织标本中的作用

临床生物样本是基础研究与临床研究的宝贵资源，规范地采集、保存生物样本可以避免样本的损坏与流失，节约资源。根据“标准”中所提及的在采集标本前需对标本进行生理盐水漂洗以去除其表面的血液及污物也是保证生物样本质量的一个重要手段。手术中的离体标本不可避免有血液污染，血液也有其DNA／RNA，若不进行漂洗而直接采集标本，则可能导致将来抽取肿瘤标本的DNA／RNA时，会受到血液DNA／RNA的影响，而影响最终的研究结果。如果采用其他溶液漂洗肿瘤标本，如灭菌注射用水，则可能会导致肿瘤细胞肿胀破裂死亡，而最终无法抽取肿瘤细胞的DNA／RNA，无法开展进一步的研究。因此，对于肿瘤标本漂洗溶液的选择当然是应该选择等渗、不影响肿瘤细胞活性、又不会添加其他成分的0.9%无菌生理盐水。

3.2 不同温度的生理盐水对采集乳腺肿瘤组织标本的影响 通过此次研究发现，用不同温度生理盐水漂洗肿瘤标本，对标本的采集、保存是有影响的。鉴定标本的保存质量主要看标本的总RNA，并用紫外分光光度计对RNA样品进行检测[2]。有研究发现样本取材时间对样本RNA质量存在着关键影响，众多文献推荐在样本切除后30min内取材[2-3]。因此，在此次实验中，我们严格控制取材时间＜30min，并由专人负责采集、送检、检验标本，力求控制影响实验结果的所有变量，仅仅观察用不同温度生理盐水漂洗后，标本总RNA的质量。由表1可看出，用不同温度生理盐水漂洗肿瘤标本后，RNA保存质量存在显著性差异（P＜0.01），用冷的甚至是冰的生理盐水漂洗肿瘤标本更能完好的保存肿瘤细胞的RNA。这是因为温度越低，越有利于降低细胞活性，避免肿瘤细胞基因组DNA、RNA和蛋白的降解。

3.3 建立乳腺肿瘤组织标本采集、保存的标准化流程 参照“标准”，并结合此次的实验结果、自身的特点，我们制定了一套符合我们医院的乳腺肿瘤生物样本采集、保存的标准化流程。我们强调采集专员在取材前准备好标有病例姓名缩写、住院号、组织部位（T／P／N）的标签的冻存管和包埋盒，组织块取下后，先用4～8℃的无菌生理盐水漂洗标本以去除血液与污渍。

综上所述，在采集乳腺癌肿瘤组织标本的过程中，使用4～8℃的无菌生理盐水漂洗标本后对肿瘤标本的RNA保存质量影响最小，可增添至生物样本采集、保存的标准化流程中。

[1]《中国医药生物技术协会生物样本库标准（试行）》[J].中国医药生物技术，2011，6（1）：71-79.

[2]季加孚.北京大学临床肿瘤学院标本库的建设[J].北京大学学报（医学版），2005，37（3）：229-330.

[3]Mager SR，Oomen MH，Morente MM，et al."Standard operating produre for the collection of flesh frozen tissue samples[J].Eur J Cancer，2007，43（5）：828-834.