冰鲜银鲳鱼优势腐败菌的分离鉴定及其致腐能力分析

张璟晶 唐劲松 管远红 王海波

(江苏农牧科技职业学院食品科技学院，江苏泰州 225300)

冰鲜银鲳能够最大程度地保持鱼肉风味和营养价值，但冰鲜水产品也极其容易腐败变质，其主要原因是由微生物引起的［1］。导致冰鲜水产品腐败的往往是少数适合生存、繁殖并产生腐败臭味代谢产物的特定优势菌群，这些优势腐败菌的生长速度和致腐能力较强，随着贮藏时间的增加，其在菌落总数中的比例不断增加［2］。因此找出冰鲜水产品的优势腐败菌对于控制该种水产品的腐败变质具有重要意义。目前国内外对于水产品中腐败菌已有研究报道，例如:蓝蔚青等［3］对冷藏带鱼的主要细菌菌相进行了分析;张雯［4］和许振伟［5］等分别对冰鲜大黄鱼肠腔细菌类群结构类型和腐败菌腐败能力进行了分析。目前仅有针对鲳鱼冷藏期间的微生物多样性进行的一些研究［6］，但对于鲳鱼中的优势腐败菌的分离鉴定及其腐败能力的分析并未见报道。

本研究拟对冰鲜银鲳中的主要腐败微生物进行分离纯化，通过形态学特征、部分生理生化检验和16S rDNA分析鉴定相结合的技术，确定腐败鲳鱼中的优势腐败菌属，并比较分析其致腐能力的大小，以便有针对性地对冰鲜银鲳的优势腐败菌加以控制，为延长冰鲜银鲳的保鲜期提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料

银鲳鱼:购于泰州市农贸市场。

1.1.2 试剂

平板计数培养基:北京陆桥生物技术有限公司;

革兰氏染液、芽孢染色液、微生物生理生化微量鉴定管:青岛海博生物技术有限公司;

用于PCR扩增的全套试剂和扩增引物:北京三博远志生物技术有限公司;

乙醇、无水碳酸钠、氢氧化钠等:分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 试验设备

电子天平:EL270型，梅特勒—托多利仪器(上海)有限公司;超净工作台:SW-CJ-ZFD型，苏州净化设备有限公司;电热恒温培养箱:HPX-9162MBE型，上海博讯实业有限公司;

立式压力蒸汽灭菌锅:LDZX-30FA型，上海博讯实业有限公司医疗设备;

PCR扩增仪:PTC-200型，北京三博远志生物技术有限公司;

凝胶成像分析仪:YLN-2000A型，北京三博远志生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 冰鲜银鲳鱼腐败菌的分离纯化 在无菌操作环境下，称取腐败鱼肉样品10 g，放入灭过菌的研钵中，加入海砂，把鱼肉研碎，加生理盐水90 mL，然后取1 mL进行10倍梯度稀释，选择3个合适的稀释度倾注平板计数培养基上，30℃培养48 h后进行菌落计数［7］。将分离出的典型菌落进行平板划线分离，反复进行以获得纯化的单菌落。依据菌落特征以及革兰氏染色、芽孢染色、细胞形状与细胞间的排列方式等特征进行初步的分类并计数，确定在总数中占有比例较高的3～4种菌为优势腐败菌。

1.2.2 优势腐败菌致腐能力的确定 用无菌水将分离纯化的优势菌株分别制成菌悬液，菌体浓度为105CFU/mL。将冰鲜银鲳流水冲洗后用酒精进行表面擦拭消毒后，分割成20 g左右的鱼肉块，后置于菌悬液中浸泡10 s后取出，4℃冰箱保存，在第1、3、5、7天进行菌落总数和挥发性盐基氮(TVBN)测定，未接种腐败菌的鲳鱼肉作对照［5］。以产量因子(YTVB-N/CFU)作为各种腐败菌致腐能力的定量指标。

式中:

N0、NS——分别表示初始点和腐败点的菌落总数，CFU/g;

ITVB-N、STVB-N——分别表示初始点和腐败点的TVB-N含量，mg/100 g。

菌落总数和挥发性盐基氮的测定分别依据按GB 4789.2—2010《食品微生物学检验 菌落总数测定》和 GB/T 5009—2008中《半微量定氮法》的方法进行测定。

1.2.3 优势腐败菌的鉴定

(1)常规生理生化试验:参照《常见细菌系统鉴定手册》［8］，对分离得到的纯菌株进行生理生化鉴定。

(2)优势腐败菌分子生物学鉴定:挑取培养18～24 h腐败菌制成菌悬液，10 000 r/min离心10 min，弃上清，加入100 μL ddH2O，制得模板DNA。以通用引物27F:5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’和 1541R:5’-AAG GAG GTG ATC CAC CC-3’进行扩增。

PCR扩增反应体系包括:模板 DNA 2 μL，引物27F 1 μL，引物 1541R 1 μL，Taq PCR Master Mix(2 × )25 μL，ddH2O 补至 50 μL。

PCR扩增程序:95℃预变性5 min，接着30个循环(95℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，30 s)，最终72℃延伸5 min。取5 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，后将扩增产物送北京三博远志生物技术有限公司测序，并登录NCBI，与数据库已知序列进行比对，获得相似性较高的菌株序列，使用MEGA 5.0软件，构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 冰鲜银鲳鱼腐败菌的分离纯化

根据在平板上分离得到菌落的形态特征(图1)，结合革兰氏染色及芽孢的有无对菌落进行分组，大致分为8组，分别计数，并计算其占全部菌落的比例，将比例超过5%的菌落定为优势腐败菌。通过表1可以确定在总数中占有比例较高的4种菌为优势腐败菌，按其比例由大到小顺序依次列为1号、2号、3号、4号菌。对筛选得到4个优势腐败菌株进一步的腐败特性研究。

2.2 优势腐败菌致腐能力的初步分析

2.2.1 优势腐败菌接种灭菌鱼肉后菌落总数和TVB-N的变化 将筛选出的4种腐败菌进行反接致腐试验。将无菌鱼肉分别浸于105CFU/mL的菌悬液中10 s后取出放于无菌塑料袋中，4℃冰箱保存，以未接种的鱼肉样品为对照。在第1、3、5、7天对鱼肉进行菌落总数和TVB-N测定。结果见图2、3。

银鲳鱼死后的腐败变质主要是由于鱼体受到细菌的污染，细菌生长繁殖所导致，因此通过菌落总数的测定可以初步判断银鲳鱼的新鲜度和腐败程度。而挥发性盐基氮(TVBN)是指动物性食品在细菌和酶的作用下，在腐败过程中蛋白质分解而产生氨以及胺类等具有挥发性的碱性含氮物质。此类物质含量越高，表明氨基酸被破坏的越多，所以TVB-N是评价鱼类肉质新鲜度的重要指标［9］。

图1 菌落平板计数示意图Figure 1 The flat schemes of total bacterial count

由图2可知:在贮藏过程中，随着时间的延长，各接种腐败菌的处理组和对照样品组的菌落总数均呈增加趋势，各处理组菌数增加幅度较大，在第5天时，分别接种1号、2号、3号菌和4号菌的处理组菌落总数均超过7.0［lg(CFU/g)］，说明接种的各优势腐败菌，在低温下仍能利用鱼肉中的营养物质迅速生长繁殖，菌数明显增加。但在后期随着鱼肉中营养物质的消耗和代谢产物的积累，菌落总数的增加趋于平缓。图3表明，TVB-N值初期增长缓慢，但在第3天以后迅速增加，在第5天时接种1号菌的样品的TVB-N达到34.3 mg/100 g，说明鱼肉已经腐败。由图2、3可知，随着菌数的增加，优势腐败菌生长而伴随TVB-N值的增加，说明优势腐败菌的生长繁殖是使鱼肉中TVB-N增加的重要原因。

2.2.2 优势腐败菌腐败能力定量分析 参照许振伟［5］，黄林［10］等方法，将腐败点时TVB-N的增加量与腐败菌落总数增加量的比值作为TVB-N的产量因子(YTVB-N)，定量分析各优势腐败菌腐败能力。结果见表2。

由表2可知，接种了1号腐败菌的鱼肉的YTVB-N明显高于其他菌株，而4号菌的致腐能力相对较弱;4株优势腐败菌致腐能力:1号＞3号＞2号＞4号。

表1 各种腐败菌菌落特征及比例Table 1 Colonial characteristics and proportion of spoilage bacteria

图2 各种优势腐败菌菌落数变化Figure 2 Growth curve of dominant spoilage bacteria

图3 接种各种优势腐败菌对TVB-N的影响Figure 3 Effect of dominant spoilage bacteria on TVB-N value

表2 各种优势腐败菌的TVB-N产量因子Table 2 Yield factors of TVB-N of dominant spoilage bacteria

2.3 优势腐败菌的鉴定

2.3.1 形态和生理生化特征 通过筛选得到的4个优势腐败菌，进行形态特征和部分生理生化特征比较，结果见表3。

2.3.2 优势腐败菌16S rRNA的PCR扩增与系统发育树的构建 由图4可知，筛选得到的4个优势腐败菌经PCR扩增后经电泳检测，均得到了1 500 bp左右的条带。将PCR扩增产物送至北京三博远志生物技术有限公司进行测序，得到16S rDNA序列后与NCBI数据库已有的序列通过BLAST比对，选取同源性较高的菌株序列构建系统发育树，见图5。

表3 各种优势腐败菌的形态特征和部分生理生化特征Table 3 Morphological and physiological characteristics of dominant spoilage bacteria

图4 4个菌株的16S rDNA PCR扩增产物电泳图谱Figure 4 Electropherogram of PCR amplification products of 16S rDNA genes from four strains

图5 16S rDNA序列同源性的4株细菌系统发育树Figure 5 Phylogenetic treeof the four strains based on 16S rDNA sequences

结合表3、图4和5可以看出:1号菌与Pseudomonas fluorescens的亲缘关系最近，2号菌与Lysinibacillus sphaericus的亲缘关系最近，3号菌与Shewanella sp的亲缘关系最近，4号菌与Microbacterium oxydans的亲缘关系最近。有研究［11］表明Pseudomonas fluorescens和Shewanella sp广泛分布于自然界，水产品携带较多，并且在低温下也能生长，是冷链流通中高水分蛋白食品的主要腐败菌，在有氧冷藏中，这两种菌也是很多鱼贝类和甲壳类的特定腐败菌(SSO)。而Lysinibacillus sphaericus和Microbacterium oxydans也是水产养殖中主要的细菌，占有绝大多数比例。在本研究中，鲳鱼优势腐败菌的致腐能力较强的为Pseudomonas fluorescens。

3 结论

本研究通过对鲳鱼中腐败菌进行分离纯化，结合菌落形态、细胞形态、生理生化特征和16S rDNA分子鉴定方法，对生长速度较快，在菌群中占有比例较高且致腐能力较强的优势腐败菌群进行了鉴定，4种优势腐败菌分别鉴定为Pseudomonas fluorescens，Lysinibacillus sphaericus，Shewanella sp和Microbacterium oxydans。同时通过致腐能力的测定，证实了在冰鲜鲳鱼的腐败变质中，Pseudomonas fluorescens的致腐能力是最强的。下一步将对冰鲜银鲳中主要的腐败菌群进行有针对性的靶向抑制，以期为延长冰鲜银鲳的货架期提供参考。

当然，传统的微生物分离鉴定方法很难真实反映微生物污染鲳鱼的多样性以及种群变化现象，下一步也将引用PCR—DGGE指纹图谱技术等，以期望更真实地反映冰鲜银鲳在贮藏期间的微生物菌群演替情况，对主要腐败菌之间的相互作用以及腐败能力进行更深入的研究，为低温保藏银鲳奠定理论基础。

1 黎柳，谢晶.水产品冰鲜技术的研究进展［J］.食品与机械，2014，30(1):259～266.

2 Lund B M，Baird-Parker T C，Gould G W.The microbological safety and quality of food［M］.Gaithersburg Maryland，USA:Aspen Publishers Inc，2000.

3 蓝蔚青，谢晶.PCR结合生理生化鉴定对冷藏带鱼主要细菌菌相组成分析［J］.食品与发酵工业，2012，38(2):11 ～13.

4 张雯，倪莉，黄志清，等.冰鲜大黄鱼肠腔细菌类群鉴定及菌群结构分析［J］.中国食品学报，2013，12(12):189 ～192.

5 许振伟，许钟，杨宪时，等.大黄鱼中复合腐败菌腐败能力的分析［J］.食品科学，2010，31(23):118 ～122.

6 蓝蔚青，谢晶，施建兵，等.冷藏鲳鱼贮藏期间的细菌种群变化［J］.食品与生物技术学报，2013，32(11):141 ～147.

7 唐劲松，徐安书.食品微生物检测技术［M］.北京:中国轻工业出版社，2012.

8 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册［M］.北京:科学出版社，2001.

9 杨宪时，许钟，肖琳琳.水产食品特定腐败菌与货架期的预测和延长［J］.水产学报，2004，28(1):106～111.

10 黄林，陈全胜，张燕华，等.冷却猪肉优势腐败菌分离鉴定及致腐能力测定［J］.食品科学，2013，34(1):205 ～208.

11 Ellis D I，Goodacre R.Rapid and quantitative detection of the microbial spoilage of muscle foods:current status and future trends［J］.Trends in Food Science and Technology，2001，12(1):414 ～424.