一种质粒DNA标准物质的定值数据统计及不确定度评定

许 丽，梁 文，李 妍，任淑贞，丁 敏，刘 刚

（上海市计量测试技术研究院，上海 201203）

0 引 言

质粒分子标准物质是一种含有外源目的基因片段的重组分子[1]，具有制备成本低，易于富集，稳定性好的优点。由于微生物检测领域部分阳性样品难以获得，带有特异性目标检测基因的质粒分子标准物质，成为解决病原微生物分子生物学检测量值溯源问题的途径之一，广泛应用于各种PCR检测领域[2]。本文研制的阪崎肠杆菌检测质粒DNA标准物质在PCR定性定量检测中可以作为阳性对照或者定量标准，解决了相关分子生物学检测实验室阳性样品缺乏的难题。本文主要报道了该标准物质在定值过程中的数据统计和不确定评定过程。

根据JJF 1343——2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》[3]的要求，我们选择第三类定值方案：使用一种或多种已经证明准确性的方法，由多个实验室合作定值。具体的定值方法分为两种：

1）紫外分光光度法（UV）。核酸分子含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，其紫外可见吸收光谱在260nm附近有一强的吸收峰。针对双链DNA，样品浓度和吸光值之间有以下关系：双链DNA样品浓度（ng/μL）=OD260×核酸稀释倍数×50，其中 OD260为核酸在260nm处的吸光值[4]。

2）高分辨电感耦合等离子体质谱（HR-ICP-MS）。由于DNA分子结构可知，对于序列已知的DNA分子，DNA分子中磷元素的含量和DNA分子的数量有固定线性关系。在DNA中，每个碱基对应一个磷原子，分子中磷元素含量（质量分数）可由下式计算：磷元素含量（P%）=碱基数×磷的原子量÷DNA分子量。因此可以通过测定DNA样品中的磷元素的含量换算出DNA的浓度，DNA浓度可由下式计算：DNA浓度=实验测定的磷元素含量÷DNA分子含磷量（P%）[5]。

在质粒DNA标准物质的研制过程中，一共有9家实验室参与了合作定值，本文报道了数据统计过程，并对实验结果的影响因素进行了分析，对测量结果的不确定度进行了评定。

1 实验部分

1.1 主要定值检测仪器与试剂

微量核酸蛋白定量仪（nanodrop ND-2000）；紫外分光光度计（Lambda950）；电感耦合等离子体发射质谱仪（Thermo Fisher Element2）。

重铬酸钾溶液标准物质（GBW（E）081609，标准值0.099 9 mol/L，相对不确定度为0.2%）；磷标准溶液（NIST，SRM3139a，10.016±0.033mg/L）等。

1.2 定值过程

一共有8家实验室使用UV法对质粒DNA标准物质进行定值，其中有1家实验室采用HR-ICPMS法。每家实验室分别对质粒DNA标准物质，平行测定8次，进行定值分析。

1.2.1 UV测定质粒DNA标准物质

实验步骤：1）用TE缓冲液作为空白溶液，使紫外分光光度计校正为零点；2）取适量DNA（根据仪器的需要）进行检测，记录仪器读数，浓度单位为ng/μL；3）每个样品检测8次，记录实验结果。

1.2.2 HR-ICP-MS测定质粒DNA标准物质

在采用元素分析法对DNA定量之前，首先要确定质粒DNA具有足够的纯度，继而需要根据质粒DNA标准物质的碱基组成和序列长度，计算其中磷元素的含量，这样就能估算适合的稀释倍数。在本实验中，我们最终将实验室研制的质粒DNA标准物质稀释2000倍，从而落在HR-ICP-MS最优的P元素检测范围[6-7]。 以磷标准溶液（NIST，SRM3139a）制备1～5 ng/mL范围标准曲线，对质粒DNA标准物质进行定量检测。经过一系列的研究和优化，最终确定HR-ICP-MS主要技术参数：冷却气流量16.86L/min，雾化气流量为1.123L/min，辅助气流量为0.99L/min，功率1350W。每个样品检测8次，并记录实验结果。

1.3 定值数据统计

在得到测定结果后，根据统计方法要求[3，8]对测定结果进行统计处理。通过统计学评估的数据如表1所示。

表1 质粒DNA标准物质pXL06定值结果1）

2 不确定度的评定

质粒DNA标准物质的定值过程带来的不确定度uchar包括数据统计引入的不确定度uchar1和通过对定值方法中测量影响因素进行分析评定的不确定度uchar2。

2.1 数据统计引入的不确定度uchar1

质粒DNA标准物质由数据统计引入的不确定度即是使用两种方法，由9家实验室合作定值数据统计引入的不确定度。由于确认的特性值恰好是各组平均值的平均值（即各组数据不存在平均值和标准偏差的不一致性），即如下式所示：

式中：——总平均值；

Yi——各组数据的平均值；

p——实验室数目。

那么，与平均值的平均值相关的合成标准不确定度的基础是标准偏差，可由下式获得：

合成标准不确定度为

相对不确定度为

2.2 定值方法中测量影响因素进行分析评定的不确定度uchar2

2.2.1 UV方法测量影响因素引入的不确定度

用UV对质粒标准物质进行定值，检测时仪器利用液体的表面张力特性控制样品池中的样品量，因此测量影响因素引入的不确定度即为仪器本身引入的不确定度。

本文用重铬酸钾溶液标准物质（GBW（E）081609）考察了紫外分光光度计在257 nm处吸光值的准确性，其中相对标准偏差为0.02%，即该相对不确定度为 0.02%（见表 2）。

表2 吸光值准确性考察

2.2.2 HR-ICP-MS方法测量影响因素引入的不确定度

1）数学模型的建立

充分考虑样品检测过程中的各种影响因素，建立不确定评估模型如下：

式中：c——质粒DNA标准物质浓度；

cs——由标准曲线求得样品液中P含量；

Vs——检测时样品最终体积；

V——吸取质粒DNA标准物质原液体积；

9.6%——质粒DNA分子中P元素含量（由碱基数×磷的原子量÷DNA分子量计算得出）。

其中质粒DNA标准物质浓度标准不确定度用uc（c）表示，由标准曲线计算的样品液中P含量标准不确定度用uc（cs）表示，样品溶液制备体积不确定度用uc（Vs）表示，吸取质粒标准物质原液时引入的不确定度用uc（V）表示。由此得到的相对标准不确定度传播率为

2）cs不确定度的计算

cs的不确定度由两部分组成：当由5种P标准溶液的质量浓度（1，2，3，4，5 ng/mL）与 P 标准物质产生的信号强度拟合的直线求得cs时测量所产生的不确定度；由标准贮备液配制成5种质量浓度标准溶液时所产生的对cs测量所产生的不确定度。

①由拟合曲线求得cs时所产生的不确定度uc，1（cs）

用HR-ICP-MS测定质粒标准物质中的P含量，利用 P标准物质（NIST，SRM3139a）配制 5种标准 溶 液 ，P 质 量 浓 度 分 别 为 1，2，3，4，5 ng/mL，用HR-ICP-MS对上述5种P标准溶液进行测定，结果见表3。

表3 各质量浓度下P标准物质质谱信号丰度测量值

根据测定结果建立标准曲线，经过线性拟合得出：

式中：A——质谱信号丰度；

cm——溶液中P元素的含量。

对cs进行8次测量，通过曲线方程求得cs=3.57ng/mL，则cs的标准不确定度[9-10]为

式中B1=3514.8；

P=8（对cs进行 8 次测量），n=5（共 5 次测量）；

将上述各值代入式（8）得到：

②配制P标准工作溶液的不确定度uc（c5）

以5ng/mL标准工作溶液为例阐述不确定度的大小，其配制步骤为：用最大量程为1 mL的移液器移取 1mL P 标准溶液（10.016±0.33）mg/L，定容至10 mL，配成1 mg/L的标准溶液，稀释因子为f1=10；用上述1mL的移液器移取1mg/L P标准溶液1mL，定容至10mL，配成0.1mg/L的标准溶液，稀释因子为f2=10；用上述1mL的移液器移取0.1mg/L P标准溶液1 mL，定容至10 mL，配成0.01 mg/L的标准溶液，稀释因子f3=10；用最大量程为5mL移液器移取0.01mg/L的标准溶液5mL，定容至10mL，配成5ng/mL标准工作溶液，稀释因子f4=2，则：

所以：

（B）1mL移液器移取1mL时引入的不确定度uc（V1）

（C）10mL 容量瓶引入的不确定度 uc（V10）

（D）最大量程为5 mL的移液器移取5 mL时引入的不确定度 uc（V5）

所以：

将上述值代入式（9），则：

则质粒DNA标准物质cs的相对不确定度合成为

3）样品溶液制备体积 Vs的不确定度 uc（Vs）

样品溶液制备过程如下：取5μL质粒标准物质原液，定容至10mL，则稀释倍数为2000倍。

①由10 μL移液器移取5 μL时产生的不确定度 uc（V0.005）

（B）移液器和溶液的温度与校正时温度不同引起的不确定度 uc，2（V1）：实验室温度控制在（20±3）℃（置信水平为95%），水的体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，因此产生的体积变化为±3×5×2.1×10-4=±0.0032μL，按照均匀分布转化：

则：

②10mL容量瓶引入的不确定度uc（V10）

所以，样品溶液体积Vs引入的相对不确定度合成为

4）吸取质粒标准物质原液时引入的不确定度uc（V）

吸取质粒标准物质原液时引入的不确定度：

因此将式（10）、式（11）、式（12）代入式（6），得到HR-ICP-MS检测质粒DNA标准物质的相对标准不确定度为：

2.2.3 两种方法测量过程影响因素引入的合成相对不确定度

将紫外方法和HR-ICP-MS方法测量过程影响因素引入的相对不确定度进行合成：

2.3 质粒DNA标准物质的定值过程引入的不确定度uchar总结

最终，将定值过程引入的相对不确定度合成：

合成不确定度 uchar=75.1×1.4%=1.05ng/μL。 取包含因子 k=2，则扩展不确定度 U=2×1.05=2.1 ng/μL，相对扩展不确定度为2.8%（k=2）。因此，测得的质粒DNA 标准物质的浓度表示为：（75.1±2.1）ng/μL（k=2）。

表4 各相对不确定度分量计算结果

3 结束语

本文应用UV和HR-ICP-MS两种方法，对质粒DNA标准物质进行定值，为了得到更准确的实验结果，并且结果可以溯源至国际单位。本文以一种质粒DNA为例，综合考虑了实验过程中影响结果的各种因素，探讨了此类定值方法过程中的不确定来源，最终对不确定度的评定方法和步骤进行了分析。

[1] Kuribara H， Shindo Y， Matsuoka T， et al.Novel reference molecules for quantitation of genetically modified maize and soybean[J].J AOAC Int，2002，85（5）：1077-1089.

[2] Brod F C， Dinon A Z， Kolling D J， et al.Development of plasmid DNA reference material for the quantification of genetically modified common bean embrapa 5.1[J].J Agric Food Chem，2013，61（20）：4921-4926.

[3] JJF 1343—2012标准物质定值的通用原则及统计学原理[S].北京：中国质检出版社，2012.

[4] Benjamin，Lewin，et al.基因 VIII[M].8版.北京：科学出版社，2007：57-69.

[5] J·莎姆布鲁克.分子克隆实验指南[M].3版.北京：科学出版社，2005：34-47.

[6] 崔启明，潘涵舜.ICP-OES不确定度评定模型的探讨[J].上海计量测试，2005，2（186）：11-14.

[7] 王翔，祝长青，等.阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）分子检测方法研究进展[J].食品科学，2011，32（13）：350-354.

[8] ISO Guide 35.Reference materials-General and statistical principles for certification[S].2006.

[9] 钱耆生.分析测试质量保证[M].沈阳：辽宁大学出版社，2004：49-52.

[10]全国标准物质管理委员会.标准物质的研制管理与应用[M].北京：中国计量出版社，2010：23-27.