电子自旋共振法与可见分光光度法对比测定葛根黄酮抗氧化性*

李银花，王海波，李洪燕

1(广东食品药品职业学院，广东广州，510520)3(广州市质量监督检测研究院，广东广州，510110)

葛根，生于荒山山坡、林地边缘、旷野路边、溪边，常缠绕在其他植物上，生长快，对气候及土质要求不高，性喜温暖、潮湿环境，但亦耐旱［1-3］。现被国家卫生部列入“药食两用”中药名录中，传统医学上用之入药，因富含淀粉，也一直是我国居民的传统食品［4-5］。实验研究证明，葛根中的有效成分为异黄酮类化合物，而葛根素是其中的主要成分［7-8］。

电子自旋共振技术(ESR)是一种新的检测物质抗氧化性的方法，通过测定物质中自由基信号的改变来表现自由基的变化［8-9］。本文采用ESR对葛根黄酮进行测定，同时与可见分光光度法进行对比，探讨不同浓度葛根黄酮在质量浓度差下对DPPH·的消除效应。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葛根药材，由广州二天堂药店提供，广东省中药研究所鉴定为粉葛(P．thomsonii Benth)的干燥根;葛根素标准品，中国药品生物制品检定所;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，美国Sigma公司;乙醇、甲醇、香兰素，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

A300电子顺磁共振波谱仪，德国Bruker公司;752-紫外分光光度计，上海分析仪器厂;FW100型高速万能粉碎机、药典检验筛 GB6003-95:3号筛(0．355mm)、电子分析天平，梅斯特-拖利多仪器上海有限公司;电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司;KQ-SOOB型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.3 实验方法

1．3．1 样品制备［10-11］

称取一定量葛根，粉碎，过3号筛，得葛根粉末。精密取2g葛根粉末，经超声波辅助提取得620．34 mg葛根粗提取物(crude extract purain，CEP)。取定量葛根粗提取物，经大孔树脂吸附，分别用体积分数(下同)30%、60%的乙醇溶液洗脱。将部分60%乙醇洗脱液浓缩，冻干成葛根黄酮粉末，按表1标记，置于冰箱4℃中保存，待用。

表1 葛根产品标记Table 1 Example of a double column table

1．3．2 葛根黄酮含量测定-可见分光光度法［12-13］

标准曲线试验方法:取30 mg葛根素标准品溶于蒸馏水中，定容至 500 mL，分别从中精密量取2．0、4．0、6．0、8．0、10．0 mL，再用蒸馏水定容至 100 mL。以蒸馏水为参比溶液，于250 nm处测定吸收值，以对照品浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，计算出回归方程。

标准曲线回归方程:Y=0．037 7+84．966x，r=0．993。其中，x，葛根素的浓度(mg/mL);Y，吸光度值;r，线性相关系数。

结果表明葛根素在0．001 2～0．006 0 mg/mL质量浓度范围内线性关系良好。

1．3．3 ESR 测定 DPPH·清除率

图1 葛根素标准工作曲线Fig．1 The standard working curve of Puera rin

电子顺磁共振波谱仪参数设置:温度25℃;调制频率 150．0 kHz;条幅2．1G;时间常数330．120 ms;扫场时间 650．500 s;中心磁场 3 800．00 G;扫场宽度85．00G;X 波段频率10．124 7 GHz;功率20．000 mW。

用95%乙醇溶液做溶剂，将1．3．1的4个样品分别稀释成10、20、40、60、80 mg/L 溶液，取 1．00 mL 2．5×10-4mol/mL的DPPH溶液混合，摇匀。将混合液装入毛细管中并封闭好，置于电子顺磁共振波谱仪谐振腔中，记下波谱图，计算波峰面积，用95%的乙醇溶液做出空白试验。

1．3．4 可见分光光度法检测DPPH·清除率

在517 nm处测定吸光度值，按公式计算:

A1:依次量取2．5×10-4mol/mL的DPPH溶液2．00 mL，分别加入 2．00 mL 10、20、40、60、80 mg/L样品溶液，充分摇匀后，暗置30 min，待测。

A2:量取蒸馏水 2．00 mL，分别加入 2．00 mL10、20、40、60、80 mg/L 样品溶液，充分摇匀后，暗置 30 min，待测。

A3:取 2．00 mL 95%乙醇溶液加入 2．00 mL 2．5×10-4mol/mL DPPH溶液，摇匀测量。

2 结果与分析

2.1 ESR法测定葛根黄酮自由基清除效果

2．1．1 10 mg/L葛根黄酮样品自由基清除效果

10 mg/L葛根黄酮样品(CEP1，CEP2，CEP3，CEP4)，在进样后0，15，30 min内测得清除 DPPH·波谱图，如图2所示。

由图2与图3可知，10 mg/L葛根黄酮在电子顺磁共振中，自由基特有的吸收波段主要在3 660～3 840 G之间。4份样品DPPH·的清除率均不高，但随着时间的延长，清除自由基的能力均有略微的提高，其中60%乙醇洗脱液冻干粉清除DPPH·的能力最强。30 min与15 min处理时间相比，4份样品30 min 处理，清除率分别提高了 26．6%，16．7%，8．9%，21．4%。

图2 10 mg/L葛根黄酮4份样品清除DPPH·波普图Fig．2 10 mg/L puerarin flavonoids four samples scavenging DPPH free radicals

2．1．2 20 mg/L葛根黄酮样品自由基清除效果

取20 mg/L葛根黄酮样品(CEP1，CEP2，CEP3，CEP4)，在进样后0，15，30 min内测得清除DPPH自由基波普图，如图4、图5所示。

图3 10 mg/L葛根黄酮4份样品清除DPPH·能力图Fig．3 10 mg/L Puerarin flavonoids four samples DPPH radical scavenging activity diagram

图4 20 mg/L葛根黄酮4份样品清除DPPH·波普图Fig．4 20 mg/L Puerarin flavonoids four samples scavenging DPPH free radicals

图5 20 mg/L葛根黄酮4份样品清除DPPH·能力图Fig．5 20 mg/L Puerarin flavonoids four samples DPPH radical scavenging activity diagram

由图4和图5可知，20 mg/L葛根黄酮4份样品清除DPPH自由基能力有所提高。在反应时间段为15 min，20 mg/L葛根黄酮4份样品 CEP1，CEP2，CEP3，CEP4 分别提高了 20．5%，22．0%，30．4%，40．5%。同样，60%乙醇洗脱液冻干粉清除自由基的能力最强。2个时间段相比，30 min比15 min处理清除率分别提高了 36．6%，37．7%，21．9%，31．4%。

2．1．3 40 mg/L葛根黄酮样品自由基清除效果

40 mg/L葛根黄酮样品(CEP1，CEP2，CEP3，CEP4)，在进样后0，15，30 min内测得清除 DPPH·波普图，如图6、图7所示。

由图6和图7可以看出，在反应15 min，40 mg/L葛根黄酮4份样品CEP1，CEP2，CEP3，CEP4较20 mg/L葛根黄酮样品自由基清除率分别提高了30．5%，33．0%，40．4%，50．5%。同样，60% 乙醇洗脱液冻干粉清除自由基的能力最强。2个时间段相比，30 min比15 min处理清除率分别提高了56．6%，57．7%，61．9%，71．4%。

2．1．4 60 mg/L葛根黄酮样品自由基清除效果

60 mg/L葛根黄酮样品(CEP1，CEP2，CEP3，CEP4)，在进样后0，15，30 min内测得清除 DPPH·波普图，如图8、图9所示。

由图8和图9可以看出，在反应时间段为15 min，60 mg/L葛根黄酮 4份样品 CEP1，CEP2，CEP3，CEP4较40 mg/L葛根黄酮样品自由基清除率分别提高了 70．5%，63．0%，60．4%，70．5%。2 个时间段相比，30 min比15 min处理清除率分别提高了66．6%，67．7%，71．9%，81．4%。60% 乙醇洗脱液冻干粉清除自由基的能力最强。在反应30 min时，自由基清除率达到了95%。

2．1．5 80 mg/L葛根黄酮样品自由基清除效果

80 mg/L葛根黄酮样品(CEP1，CEP2，CEP3，CEP4)，在进样后0，15，30 min内测得清除 DPPH·波普图，如图10、图11所示。

图6 40 mg/L葛根黄酮4份样品清除DPPH·波普图Fig．6 40 mg/L Puerarin flavonoids four samples scavenging DPPH free radicals

图7 40 mg/L葛根黄酮4份样品清除DPPH·能力图Fig．7 40 mg/L Puerarin flavonoids four samples DPPH radical scavenging activity diagram

图8 60 mg/L葛根黄酮4份样品清除DPPH·波普图Fig．8 60 mg/L Puerarin flavonoids four samples scavenging DPPH free radicals

由图10和图11可以看出，80 mg/L葛根黄酮4份样品清除率均有大幅提高。在反应时间段为15 min，80 mg/L葛根黄酮 4份样品 CEP1，CEP2，CEP3，CEP4较60 mg/L葛根黄酮样品自由基清除率分别提高了 60．5%，67．0%，70．4%，60．5%。2 个时间段相比，30 min比15 min处理清除率分别提高了36．6%，37．7%，31．9%，41．4%。60% 乙醇洗脱液冻干粉清除自由基的能力最强。在反应30 min时，自由基清除率几乎达到了100%。

图9 60 mg/L葛根黄酮4份样品清除DPPH·能力图Fig．9 60 mg/L Puerarin flavonoids four samples DPPH radical scavenging activity diagram

图10 80 mg/L葛根黄酮4份样品清除DPPH·波普图Fig．10 80 mg/L Puerarin flavonoids four samples scavenging DPPH free radicals

图11 80 mg/L葛根黄酮4份样品清除DPPH·能力图Fig．11 80 mg/L Puerarin flavonoids four samples DPPH radical scavenging activity diagram

从上述情况来看，不管在15 min或是30 min，在相同的质量浓度下，60%乙醇洗脱液冻干粉CEP4对自由基的清除率都是最高，由此说明了葛根的60%乙醇洗脱液冻干粉对抗氧化能力最强;同时在一定质量浓度范围内，葛根素提取液对自由基的清除率出现剂量效应，在比较低质量浓度时，对自由基的清除能力比较弱，随着质量浓度的升高，自由基的清除能力也相应的提高。当质量浓度为60 mg/L，对自由基的清除率出现了大幅度的提高，其平均清除率达到了90%，其原因主要是在不同提取液中葛根素的含量不同。从反应时间来看，相同的质量浓度，30 min处理时间对自由基的清除率均高于15 min的清除率。其主要原因是反应时间过短，样品中的葛根素与自由基没能完全进行结合。在反应30 min，不够量的样品也没有办法将自由基完全清除。而80 mg/L60%乙醇洗脱液冻干粉(CEP4)自由基清除率达到了100%，自由基清除效果最好。

2.2 可见分光光度法测定葛根素对自由基清除率的结果

图12 4份葛根样品对DPPH·的清除效果图Fig．12 Samples for four DPPH radical scavenging effect diagram

从图12中可以知道，可见分光光度法测定的4种不同葛根素提取液均有清除自由基的能力，同时样品质量浓度提高对应的自由基清除率也提高，4份样品对自由基清除能力大小分别是CEP4＞CEP3＞CEP2＞CEP1，其中60%乙醇洗脱液冻干粉在不同浓度和不同处理时间上效果最好。分光光度法与ESR法测得的4份样品清除率来比较，相同时间，相同浓度下，分光光度法普遍低于ESR法测得的4份样品清除率。这说明ESR更能灵敏地反应出葛根素对自由基的清除能力。

3 结论

本研究采用了可见分光光度法和电子自旋共振检测技术测定4份不同葛根素提取液对DPPH·清除能力的比较，得出葛根素有很强的抗氧化能力。在ESR测定法里，不同的反应时间，同一份样品对DPPH·的清除率和质量浓度成正比例关系，在质量浓度为60 mg/L时，自由基的清除率有显著的提高。ESR处理时间30 min，60%乙醇洗脱液葛根冻干粉自由基清除率可以达到100%。通过2种方法的比较，表明电子自旋共振检测技术检测自由基清除效果要明显好于可见分光光度法，ESR法能更灵敏、更准确地测定自由基清除效果。

［1］李银花，宋卉．不同方法水抽提葛根有效成分的对比性研究［J］．时针国医国药，2011，22(1):49-51．

［2］李银花，宋卉．超声波法水抽提葛根素工艺研究［J］．食品研究与开发，2010，31(6):14-17．

［3］Junghyun Kim ，Ki Mo Kim ，Chan-Sik Kim，et al．Puerarin inhibits the retinal pericyte apoptosis induced by advanced glycation end products in vitro and in vivo by inhibiting NADPH oxidase-related oxidative stress［J］．Free Radical Biology and Medicine ，2012，53(6):357-365．

［4］李旭洲，韩立炜，张岩峰等．葛根中葛根黄酮的水提取及大孔树脂纯化工艺研究［J］．北京中医药大学学报，2009，32(9):626-629．

［5］邵兰兰，赵燕，杨有仙，等．葛根异黄酮、淀粉的提取及葛产品开发研究进展［J］．食品工业科技，2012，33(6):452-454．

［6］赵艳景，张岩．葛根抗氧化肽的分离及清除自由基活性研究［J］．食品科学，2012，33(13):112-115．

［7］王艾平，周丽明，林国卫．葛根渣中抗氧化物质水提工艺的研究［J］．江苏农业科学，2013，41(2):249-250．

［8］裴凌鹏 ，李文川，唐粉芳．葛根总黄酮成分的超声提取及抗氧化作用［J］．北京联合大学学报，2003，17(3):25-27．

［9］刘逢芹，董其亭，李宏建，等．野葛根、藤及其提取物中相关异黄酮成分的含量测定［J］．中国中药杂志，2007，32(14):12-16．

［10］冯维希，胡红，张爱丽．HPLC测定云台山葛根不同部位葛根素的含量［J］．西北药学杂志，2006，22(3):110-111．

［11］罗琼，郝近大，杨华．葛根的本草考证［J］．中国中药杂质，2007，32(12):1 142-1 143．

［12］陶娟，许慕农，路秋生，等．中国葛属植物资源和利用情况［J］．中国野生植物资源，2007，26(3):30-33．

［13］Yong P H，Hyung G K，Tran T H，et al．Puerarin activates endothelial nitric oxide synthase through estrogen receptor-dependent PI3-kinase and calcium-dependent AMP-activated protein kinase［J］．Toxicology and Applied Pharmacology ，2011，257(6):48-58．