乳制品乳酸菌遗传学概述*

焦晶凯，刘振民，莫蓓红

(乳业生物技术国家重点实验室，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海，200436)

乳酸菌作为人和动物肠道的正常菌群，具有阻止病原菌对肠道的感染和侵害、抑制内毒素的产生、维持肠道的微生态平衡、提高机体免疫力、预防和抑制肿瘤的发生、降低胆固醇、延缓衰老和抗辐射等功效。乳酸菌还有抑制过敏发炎反应，对气喘、异位性皮肤炎有很好的效果。特别是口服乳酸菌具有免疫耐受性作用，微量释放过敏原疫苗蛋白，降低过敏炎性反应，改善气喘和减少过敏性鼻炎发作的机会等［1］。

新的分子生物学技术极大地促进了在宿主微生物区系水平上对乳酸菌益生作用的研究，乳酸菌遗传学的主要突破是基因组学研究的进步，目前已成功获得了几个种类乳酸菌的全基因组序列［2］。全基因组序列无疑会提高我们对乳酸菌代谢、乳酸菌间水平基因转移及其生态作用的认识和了解。特别是在乳糖和柠檬酸代谢、蛋白质水解［3］、噬菌体抗性机制及细菌素产生等方面，通过全基因组序列可以了解这些过程是如何被控制或调节的。详细的序列信息可以在转录和翻译水平上开辟基因表达分析的途径，从而进一步推断这些微生物在益生方面的代谢模式。随着人们对分子生物学的进一步了解以及生物信息学研究的深入，在宿主基因表达水平上研究益生菌与宿主相互作用亦成为可能。

1 基因组成

细菌中的基因组成分为两个部分，大部分基因作为主要DNA分子存在于细菌染色体中，另一小部分储存于自主复制的质粒中。乳酸菌遗传学研究的主要是它们当中的质粒和噬菌体，这些质粒和噬菌体在乳酸菌中起着比较重要的作用，对比染色体，采用分子遗传分析方法来分析的质粒和噬菌体更加容易获取和研究。众所周知，好的发酵剂菌株对于乳制品发酵来说至关重要，但是这些菌株的某些特性并不稳定，而大部分原因归咎于质粒的缺失，质粒的编码消除等对菌株的特性至关重要。

1.1 质粒DNA的检测及其丰度

1972年，Mckay等人［4］推断乳酸链球菌(Str.lactis)丧失利用乳糖的能力可能是由于质粒消除引起，此后乳酸链球菌染色体外DNA研究开始映入人们的视线。对质粒研究之初，是通过显微镜对放射性标记的质粒DNA进行检测的。对这种质粒DNA进行电子显微镜检查发现，这些不同大小的环状质粒分子可以由其拉伸长度进行评定。随后研究者发现，琼脂糖电泳可以更加快速而有效的进行乳酸菌质粒DNA的检测。随着技术研究的进步，对质粒DNA检测技术更加完善，分子质量超过30兆道尔顿的质粒DNA可以很容易的被检测出来。目前已发展了更多快速筛选菌株中质粒含量的方法［5］。

质粒谱提供了一个有效的“指纹图谱”，可以更简便地去观察菌株特性及其相互之间的关系。通过质粒谱观察到乳酸链球菌(Str.lactis)菌株和乳脂链球菌(Str.cremoris)菌株中包含大而复杂的质粒，相反，菌株嗜热链球菌(Str.thermophilus)不包含质粒或包含质粒数目较少。不同乳杆菌中所包含的质粒数目差异较大，通常乳杆菌中不包含或仅仅包含一个质粒，但如嗜酸乳杆菌(Lb.acidophilus)等菌株包含多个质粒。片球菌(Pediococci)包含0～2个质粒，Leuconostoc包含2 个质粒［6］。

1.2 质粒消除法和表型归属性

研究发现，质粒的突然消失能够对表型带来影响，吖叮黄、溴化乙锭浓度和温度的增加对消除频率会产生影响，由此通过观察菌株间基因转移的特征得出表型是由质粒基因控制的结论。找到决定菌株表型的质粒中特定分子是目前的一大研究热点。质粒消除法对研究特定质粒的特性尤为重要，例如乳酸链球菌712(Str.lactis712)和双醋酸乳链球菌176(Str.Lactis diacetylactis 176)中的乳糖质粒，研究者们观察了在原生质体恢复之后乳酸链球菌712(Str.lactis 712)质粒的消除现象，并通过连续的对质粒进行消除获得了仅携带特定质粒分子的菌株及非携带质粒的菌株。通过观察这些“衍生”的菌株的表型，可以清晰地辨别出乳糖质粒分子，这是通过传统的表型消除法和质粒图谱分析难以实现的。乳酸链球菌复杂的质粒组成为分析质粒编码的基因转移引起的表型的改变带来很大困难，并且使对纯化质粒进行分子分析更加复杂化，基于以上原因，分离出带单一质粒的菌株及非携带质粒的菌株更具有重要意义，目前，已经成功使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍试剂分离出非携带质粒的乳酸链球菌712(Str.lactis 712)和乳酸链球菌C2(Str.lactis C2)、通过使用”原生质体消除”法获得了非携带质粒的乳酸链球菌TL1987(Str.lactis TL1987)、通过吖叮黄获得了非携带质粒的双醋酸乳链球菌176(Str.lactis subsp.diacetylactis 176)及通过提高温度的方法获得了非携带质粒的双醋酸乳链球菌BU2(Str.lactis subsp.diacetylactis BU2)和乳脂链球菌1200(Str.cremoris 1200)。

1.3 乳糖和蛋白酶质粒

表型、遗传、物理等多种方法已被用来证明在乳链球菌中乳糖的发酵能力是由质粒编码调控的。在20世纪30年代有学者就研究了乳糖发酵能力的突然消失的原因，1972年McKay等人研究得出增加吖叮黄的浓度或增加温度可引起乳糖质粒消除的增加［4］。研究已证明在乳酸链球菌(Str.lactis)和双醋酸乳酸链球菌(Str.Lactis subsp.diacetylactis)中乳糖基因是由特殊的分子控制的。由消除实验鉴定了在菌株乳脂链球菌B1(Str.cremoris B1)中含有36Mdal乳糖质粒，但在该属的其他菌株中，并未得到相关的乳糖质粒［7］。随后，有学者研究当一些乳脂链球菌(Str.cremoris)菌株作为供体与乳酸链球菌(Str.lactis)进行基因转移时，乳糖基因转移和质粒分子的转移表现出了一定的相关性，Snook和McKay［8］推断乳脂链球菌(Str.cremoris)菌株可能携带了罕见稳定的乳糖质粒。而有研究者发现一个非携带质粒的乳脂链球菌菌株1200(Str.cremoris 1200)依然保留了乳糖发酵能力，因此，在不同乳脂链球菌(Str.cremoris)菌株中乳糖表型差异很大，一些携带了乳糖质粒，一些仅包含染色体乳糖基因，此外在一些乳杆菌中也鉴定出了乳糖质粒。

已有学者致力于研究菌株中的乳糖分解代谢途径中的酶是由哪一种质粒基因调控的。有研究得出在乳酸链球菌C2(Str.lactis C2)和乳脂链球菌B1(Str.cremoris B1)菌株里磷酸稀醇式丙酮酸依赖性磷酸转移酶(PTS)系统中用于糖的摄取的酶Ⅱ、因子Ⅲ和乳糖分解酶-磷酸-β-半乳糖苷酶是由质粒编码基因调控的［9］。有学者采用乳糖阴性突变的方法证实乳酸链球菌11454(Str.lactis 11454)菌株乳糖质粒携带有关编码乳糖磷酸转移酶和磷酸-β-半乳糖苷酶的基因。另有学者发现D-塔格糖-6-磷酸途径中的3种酶(塔格糖-6-磷酸异构酶、D-塔格糖-6-磷酸激酶、塔格糖-1，6-二磷酸醛缩酶)的基因与乳酸链球菌Str.lactis C10、H1和133菌株的乳糖质粒相关。干酪乳杆菌64H(Lb.casei 64H)也被研究发现其中的乳糖质粒编码乳糖磷酸转移酶系统中的酶和磷酸-β-半乳糖苷酶［10］。半乳糖的利用也受乳糖质粒的消失的影响。目前已获知乳酸链球菌(Str.lactis)的乳糖阴性突变体减缓了乳糖的增长率。

由于乳酸链球菌是营养依赖型微生物，而牛奶中缺乏足够的游离氨基酸或小的肽类，需要将牛奶中酪蛋白分解，因此发酵剂的生长和产酸量依赖于发酵剂细胞壁上蛋白酶分解酪蛋白的能力。失去这种分解蛋白的能力会导致产酸量的减少。McKay等人［11］和Klaenhammer等人［12］证实质粒消除法可以得到这种产酸量少的突变体。蛋白酶质粒已在一些乳脂链球菌(Str.cremoris)中鉴定出来。

乳酸链球菌(Str.lactis)的蛋白酶质粒鉴定有很多不确定性，主要是因为该表型特点与乳糖基因调控之间存在一定的相关性。在乳酸链球菌(Str.lactis C2、ML3、712、C10、M18)和双醋酸乳酸链球菌(diacetylactis DRC1)中，均表现乳糖和蛋白酶表型特征的同时消失与一个大小为30～45 Mdal的质粒相关，同时也发现了一些与之不同的现象，如保留了乳糖基因的乳酸链球菌C2(Str.Lactis C2)蛋白酶阴性突变体丢失了大小为12.5Mdal和18Mdal的质粒而保留了30Mdal的质粒分子［12］。近期有学者进行了高频率的删除组织构架和对一种未知的质粒的高频率消除实验［13］，对解释这些复杂现象起到了一定的作用。首先，很容易从乳酸链球菌712(Str.lactis 712)消除一个9Mdal的质粒，而大多数这些消除质粒的菌株通常表现为乳糖或蛋白酶阴性突变体。这个9Mdal的质粒并不调控乳糖基因或蛋白酶基因，但却对这2个基因的表型有极大的影响，由此可以看出质粒与表型表现相关性是有条件的。第2，乳酸链球菌712(Str.lactis 712)的乳糖和蛋白酶质粒受支配于删除组织构架的频率。根据分子出现的位置的不同，通过消除实验可以得到3种表型的菌株，分别是Lac-Prt-、Lac-Prt+和Lac+Prt-。再者，消除小于等于10%的质粒DNA并不能通过琼脂糖凝胶检测出来。pLP712的转导实验中，为了接受来自噬菌体头部的DNA需要破坏受体的组织结构，根据破坏位点的不同得到了2种转导产物，Lac+Prt+和Lac+Prt-。另外将乳酸链球菌(Str.Lactis 712、ML3、C2)中的乳糖质粒接合转移到非携带质粒菌株乳酸链球菌712(Str.Lactis 712)中，3种菌株转移后均得到了Lac+Prt+和Lac+Prt-两种表象的菌株，并由限制性内切酶进行酶解，对这些质粒进行了对比，Lac+Prt-型菌株携带了1个了与蛋白酶质粒类似的质粒但是该质粒缺少了1个编码蛋白酶的区域。乳酸链球菌(Str.Lactis)菌株似乎通常携带了1个同时编码乳糖基因和蛋白酶基因的质粒，但是消除实验可能破坏了该质粒与2种表现型之间的遗传关系。

1.4 编码表型的其他质粒

随着乳糖和蛋白酶基因的研究，双醋酸乳链球菌(Str.Lactis sub.diacetylactis)菌株发酵柠檬酸(Cit)的能力也被发现，Kempler和McKay［14］采用吖啶橙消除法分离了Cit-突变体和菌株18-16、DRC1。另外，拮抗控制质粒也得到了广泛的研究，Neve等人使用消除法和接合转移实验鉴定了乳脂链球菌(Str.cremoris)菌株4G6和9B4及双醋酸乳链球菌6F7(Str.Lactis sub.diacetylactis 6F7)中的细菌素质粒［15］。目前，已成功分离了乳酸链球菌 354-07(Str.lactis 354-07)编码葡萄糖和甘露糖基因大小为23Mdal的质粒和乳酸链球菌DR1253(Str.Lactis DR1253)中的木糖质粒。并成功从1株乳酸链球菌71(Str.lactis 71)中将卡钠徽素抗性质粒转进了枯草芽孢杆菌(Bacillus sbtilis)中，这是第1个关于在乳链球菌中存在药物抗性质粒的报告。无机离子抗性和无机离子敏感型特性被鉴定是由质粒编码调控的。乳酸链球菌C2(Str.lactis C2)的乳糖质粒控制砷酸盐、亚砷酸盐和铬酸盐抗性和对铜的敏感特性，乳脂链球菌Wg2(Str.cremoris Wg2)中的1个6.1Mdal大小的质粒可能调控对铜的抗性特征［16］。菌株的其他特征也可能是质粒调控的，如对乳过氧化物酶-硫氰酸盐-过氧化氢系统抗性、乳脂链球菌(Str.cremoris)菌株菌毛的生长和双醋酸乳链球菌(Str.lactis sub.diacetylactis)菌株精氨酸水解的调控，仍需进一步研究。

2 基因转移过程

2.1 转导

第1个比较详细的有关乳链球菌基因转移的叙述是乳酸链球菌C2(Str.lactis C2)中的噬菌体介导的转导［17］。更早的转导相关报道还有乳酸链球菌C2(Str.lactis C2)中的链霉素抗性基因的转导和双醋酸乳链球菌18-16(Str.lactis sub.diacetylactis 18-16)中的色氨酸独立性转导，采用的是烈性噬菌体，而McKay关于乳酸链球菌C2(Str.Lactis C2)的研究和随后的所有通过转导进行基因转移的实验都是采用温和的噬菌体。

McKay等人对乳酸链球菌C2(Str.Lactis C2)中染色体标记的麦芽糖和甘露糖基因和质粒调控的乳糖基因转导进行了检测［18］。在后续实验中发现选取的乳糖转导子供体中大概有50%的转导子伴随着非选择性的蛋白酶基因的转导。使用噬菌体对一个乳酸链球菌C2(Str.Lactis C2)乳糖转导子基因进行了转导重复实验，发现乳糖基因的转移频率显著增加了，该现象同样出现在了其它转导系统中，这样的转导称为高频转导(HFT)。除乳糖质粒外，有学者对一个来自于粪链球菌(Str.faecalis)大小为17Mdal的红霉素抗性质粒进行了转导，但并未发现高频转导(HFT)现象［19］。

近来，有学者成功将由温和噬菌体介导的乳脂链球菌C3(Str.cremoris C3)的乳糖基因分别转移到了乳酸链球菌(Str.lactis ML3)和一个非携带质粒的乳酸链球菌 C2(Str.lactis C2)突变体中［20］。

转导这种基因转移方式是有限制的，只有具备相应噬菌体受体的宿主菌株才可以用来进行基因转移，同时噬菌体的头部容量限制了转移的DNA的数量，而头部容量的限制会影响遗传物质的结构。那些相对于噬菌体头部来说分子太大难以被全部容纳的基因，乳糖质粒的转导过程中会引起基因缺失的产生［13］。这种基因缺失的产生对于质粒编码基因在限制酶切割图谱中的分析是非常有用的。

此外，转导有时会引起乳糖和蛋白酶质粒基因整合到细菌染色体上，产生了2个非常重要的现象，即基因通过转移到染色体上而使遗传变得非常稳定，另外，降低了基因表达水平［20］。有学者证实染色体上整合蛋白酶基因的菌株乳酸链球菌C2(Str.lactis C2)减少了蛋白水解能力，由此降低了苦味物质的产生，从而得到了由此菌株发酵的风味更佳的奶酪产品［21］。

2.2 接合转移

了解乳链球菌中通过交配过程进行的基因转移要求对细胞与细胞间的接触有深入的研究。最早的研究是关于乳酸链球菌712(Str.lactis 712)之间的质粒编码乳糖基因的接合转移和由双醋酸乳链球菌18-16(Str.lactis sub.diacetylactis 18-16)菌株的质粒转移到非携带质粒乳酸链球菌C2(Str.lactis C2)突变体的研究［22］。随后检测出更多不同菌株间的乳糖质粒的转移，如从乳酸链球菌ML3(Str.lactis ML3)、乳酸链球菌C2(Str.lactis C2)、乳脂链球菌C3(Str.cremoris C3)和双醋酸乳链球菌(Str.Lactis sub.diacetylactis DRC3，11007，WM4)转移到同样突变的乳酸链球菌C2(Str.lactis C2)中，从乳脂链球菌(Str.cremoris R1，EB7，28，C3)中转移到突变的乳酸链球菌ML3(Str.lactis ML3)中，从乳脂链球菌C3(Str.cremoris C3)中转移到乳脂链球菌B1(Str.cremoris B1)突变体中。一个来自干酪乳杆菌64H(Lb.casei 64H)菌株的乳糖质粒已经被证明具有接合转移的能力［10］。目前已在一些交配实验获得的杂合体菌株中分离出了高频率的转移供体菌株。这样的高频突变菌株最早在乳酸链球菌712(Str.lactis 712)菌株中发现，这些菌株表现了新的细胞聚集现象，该现象使得菌株的菌落形态和在培养基上的生长特征发生了显著的变化。在乳糖质粒从乳酸链球菌ML3(Str.lactis ML3)转移到一个非携带质粒的乳酸链球菌C2(Str.lactis C2)突变体过程中，也发现了高频的子菌株。有学者将从高频子菌株乳脂链球菌(Str.cremoris C3，Z8)中得到乳糖质粒及一代乳酸链球菌ML3(Str.lactis ML3)中的质粒转移到了另一株乳酸链球菌ML3(Str.lactis ML3)宿主菌株中，进行对比，发现由于插入了新的DNA片段，这些由高频接合转移得到的子菌株包含了扩大的乳糖质粒［23-24］。从进化的观点来看，细胞聚集也是复杂的诱导共轭系统中的一个现象并在一些粪链球菌(Str.faecalis)菌株中发现此共轭系统的作用。

开始时仅作为粪链球菌DS-5(Str.faecalis DS-5)［25］中的特殊质粒的红霉素抗性质粒pAMβ1自发遗传到了不同种类的革兰氏阳性种和属的细菌中，成为一种在体内发展和载体构建方面具有重要作用的质粒。该质粒首次从一个溶菌素缺陷菌株粪链球菌DS-5(Str.faecalis DS-5)中转移到了乳酸链球菌712(Str.lactis 712)中，随后该质粒从乳酸链球菌712(Str.lactis 712)中被转移到了其他乳酸链球菌(Str.lactis)，乳脂链球菌(Str.cremoris)，双醋酸乳链球菌(Str.Lactis sub.diacetylactis)和嗜热链球菌(Str.thermophilus)中，此外，该质粒还被转移到唾液乳杆菌(Lb.salivarius)，嗜酸乳杆菌(Lb.acidophilus)，干酪乳杆菌(Lb.casei)，罗伊乳杆菌(Lb.reuteri)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中。转移过程中也会遇到一些问题，如一些转移频率是非常低的，还有些转移是无法被检测到的，解决这些问题的一种方法就是分离受体能力更强的突变体，该方法已成功应用于提高pAMβ1转移到嗜热链球菌1526(Str.Thermophilus 1526)中的转移频率，每一个受体转移频率从4.2×10-7提高到2.9×10-2。此外将一个分布广泛的可遗传的药物抗性质粒作为对比进行了试验，Gonzalez＆ Kunka［6］成功将氯霉素和红霉素抗性质粒pIP501转移到了戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和乳酸片球菌(Pediococcus acidilaciti)菌株中，质粒pAMβ1在这些菌株中却不能成功转移。很多细菌素质粒、控制蔗糖利用质粒、nisin和双球菌素产生质粒类似基因模块可以通过接合转移来影响他们自身的转移。

接合转移在构建新的乳制品发酵剂菌株方面具有广泛应用潜力。该方法没有转移DNA容量的理论极限。pAMβ1接合转移的混杂性质使得在差异较大的菌株间的转移成为可能。乳糖质粒可以转移非自身的可遗传的乳酸链球菌(Str.lactis)菌株中的隐秘的质粒。另外还发现了一种新型的具有潜力的接合转移，即转座子，并在粪链球菌(Str.faecalis)菌株中得到验证。可遗传的四环素抗性转座子Tn916被成功转移到了乳酸链球菌(Str.lactis M1中)，这种在乳链球菌中结合了转位技术的新型基因转移系统具有广阔的开发应用前景。

2.3 转化和转染

将纯化的DNA导入可繁殖细菌这一过程对于基因转移有重要的意义，因为它是基因克隆技术出现的前提条件。目前还不能将整个细胞倒入繁殖细菌，主要是将DNA导入细菌原生质体的方法进行转化。原生质体溶解和再生主要依赖细胞壁的溶解，溶解使用的酶有溶菌酶、变溶菌素或结合的淀粉酶和溶菌酶。目前为止，仅有Kondo和 McKay［26］使用的聚乙二醇转化实验成功，他们对乳酸链球菌ML3(Str.lactis ML3)原生质体进行处理，引入了一个缩短的乳糖质粒，目前已经成功获得了大约105/μg DNA转化子的频率。

2.4 原生质体融合

通过聚乙二醇来融合原生质体已成功实现了基因转移。有学者使用带有遗传标记的乳酸链球菌712(Str.lactis 712)间的质粒和染色体基因进行转移。原核生物的原生质体融合是一种特殊基因转移过程，因为它是非特异性且包含整个基因组的转移而不是部分DNA的单向转移，这对于开发新型发酵剂菌株来说是一种非常有效的技术。针对发酵剂菌株用途的偏好性进行遗传是非常困难的，而且该性质特也可能是被多基因控制的，有可能分布在染色体周围。但通过原生质体融合技术可以得到混合的基因遗传产物，此项技术将会使这种复杂的性状转移在一定程度上成为可能。

2.5 基因克隆技术

基因克隆技术是解决遗传复杂性的有效手段之一。它为分离一个单独组织的基因提供了可能，也为引入这些基因来构建一个新的发酵剂菌株提供了可能。有学者将氯霉素和红霉素抗性基因克隆到一个乳脂链球菌Wg2(Str.Cremoris Wg2)小的隐蔽性质粒中，并成功获得了一个抗性载体。这种杂交分子具有特殊的限制酶BclⅠ和BglⅡ的酶切位点，从而可以利用插入失活这一特性。该质粒不仅可以在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中复制，也可以在大肠杆菌(Escherichia coli)复制，它可以在多宿主细胞中作为穿梭载体，这一性质是非常有价值的。基因工程菌株还未用于食品和乳制品工业相关应用中，有人认为将含药物抗性基因的传统克隆载体直接在食品工业上使用是不安全的，所以有必要使用乳链球菌和乳杆菌等原始乳制品相关菌株的代谢质粒进行载体的构建。目前有许多实验室正使用现有的基因工程构建系统克隆，从而进行合适的代谢质粒的分子分析及相关发酵剂基因的分离。

3 质粒和基因转移的分子学研究

限制酶图谱是研究质粒分子之间的关系及发生变化的有效手段。结合缺失定位法和克隆可以将特殊的基因功能植入DNA中，同时可以推进对基因转移过程的分子生物学分析。

3.1 限制酶图谱

目前已经绘出了已知代谢功能的多种质粒和可以进行转染的噬菌体的限制酶图谱。图1显示的是双醋酸乳链球菌176(Str.lactis subsp.diacetylactis 176)的柠檬酸质粒pCT176限制酶图谱，该质粒与其它菌株的柠檬酸质粒大致是一样的，并且可以用作代谢载体的基础。这是惟一一个了解其功能及了解其在简单鉴别培养基中生长中表型特征的多拷贝质粒，该质粒的限制酶图谱显示了特殊的临近的配对位点，这些位点对应的限制酶有 Bam HI、BclⅠ、BglⅡ、ClaⅠ、Eco RⅠ和XhoⅠ，所有这些限制酶都可用于基因克隆。

图1 柠檬酸质粒pCT176限制酶切图谱Fig.1

Loof等人发现噬菌体 P008基因组包含一个19.6Mdal具有粘性末端的双链DNA，并绘制了它的限制酶图谱，发现了限制酶BclⅠ、BglⅡ和HindⅢ的特殊的位点［27］。因为该噬菌体的DNA可以被转移进入原生质体，所以它可作为一个有潜力的噬菌体载体。

有学者采用38种不同的限制酶对来自乳酸链球菌712(Str.lactis 712)的55kb的pLP712质粒进行了分析，并且绘制出了综合图谱［13］。图谱中显示了pLP712中的消除位点，图谱中还将控制乳糖利用、蛋白酶生产和质粒复制的区域划分出来。Kok等人使用7种不同的限制酶绘制了来自乳脂链球菌Wg2(Str.Cremoris Wg2)的17Mdal的蛋白酶质粒［28］。

3.2 乳酸菌的克隆基因

目前已有学者成功进行了发酵剂菌株在宿主细胞中的的基因表达和克隆。使用链状球菌的载体pDB101将来自乳酸链球菌C2(Str.lactis C2)菌株的乳糖基因克隆进了血链球菌Challis(Str.sanguis Challis)菌株的乳糖阴性突变体中。被克隆的乳酸链球菌(Str.lactis)基因补充了新宿主细菌的磷酸-β-半乳糖苷酶突变和磷酸转移酶系统突变。Lee等人［10］构建了干酪乳杆菌64H(Lb.casei 64H)乳糖质粒大肠杆菌(E.coli)基因库并且成功分离了一株表达磷酸-β-半乳糖苷酶基因的克隆菌株，检测了酶活性，同时用大肠杆菌(E.coli)微小细胞验证了放射性同位素标记蛋白的存在。有学者试图克隆pLP712质粒中控制蛋白酶活性的基因，使用多拷贝大肠杆菌(E.coli)载体pAT153，通过分离缺失图中片段，但并未成功。另也曾试图克隆乳脂链球菌(Str.cremoris)质粒pWV05的蛋白酶基因到大肠杆菌(E.coli)中，亦未能成功，原因可能为在大肠杆菌(E.coli)中蛋白酶的表达是致死的，目前研究者已开始研究替代大肠杆菌(E.coli)的方法来克隆蛋白酶基因。

3.3 转导的分子生物学分析

有学者对乳酸链球菌(Str.lactis C2、712、ML3)中的乳糖基因进行转导，创造了新的乳糖质粒，该质粒与噬菌体基因组大小匹配，这些质粒在转移实验中增加了转导的频率，此外，这些质粒可能携带了蛋白酶基因［17］。有学者使用乳酸链球菌(Str.lactis 712)的限制酶分析对噬菌体DNA、pLP712质粒DNA和一些Lac+Prt+、Lac+Prt-转导质粒进行了对比。转导质粒含有部分缺失的pLP712质粒DNA，而未携带噬菌体DNA。Lac+Prt+转导产物具有单一的基因缺失，并表现一定的一致性。相反，Lac+Prt-转导产物是不一致的，并且含有两个或多个基因缺失。天然乳糖质粒pLP712是不稳定的，而且很容易发生缺失现象［13］。对溶菌原进行诱导后，一个大小合适的自发缺失的乳糖质粒也许会被错误的转入噬菌体头部，缺失的乳糖质粒可能就会进行转导，采用pLP712的限制酶图谱和缺失图谱可以进一步解释Lac+Prt-转导产物多个基因缺失发生的原因。

在对乳糖质粒进行转导之后，有学者对包含隐蔽性质粒补体的乳酸链球菌(Str.lactis 712)菌株的乳糖质粒进行了转导实验［19］，同时也进行了插入染色体的实验，实验后发现了大的新的乳糖质粒，大小分别是44Mdal和55Mdal。在这些大的乳糖质粒转移进入非携带质粒的菌株后，对其进行了分子生物学分析，发现它们是通过与一个受体隐蔽性质粒重组转导后形成的。

3.4 乳糖质粒接合转移的分子生物学分析

有学者将来自乳酸链球菌(Str.lactis ML3)的乳糖质粒接合转移进入一个非携带质粒的乳酸链球菌(Str.lactis C2)突变体和非携带质粒的乳酸链球菌(Str.lactis 712)后，产生了变异的菌株，变异的菌株具有高供体能力，并且表现为细胞聚集型组成型表达。对这些菌株进行碱变性裂解实验后发现这些菌株具有扩大的乳糖质粒［23］，同样有些表型不变的菌株也具有扩大的质粒。有学者对这2种扩大的质粒分别与Str.lactis ML3的天然乳糖质粒进行了对比，扩大的分子包含了完整的乳糖质粒，但插入了新的DNA 分子［24］。

Anderson和McKay［5］使用重组缺陷的乳酸链球菌(Str.lactis ML3)菌株验证了插入过程与宿主细胞生成的重组系统是相互独立的，并绘制了大量的扩大的乳糖质粒的限制酶图谱，这些乳糖质粒有些具有表型变化，有些不具有表型变化，并发现这些新的DNA的原始结构都是环形的，可以在乳糖质粒的固定位置以不同的指向自发的进行融合。插入的环形分子的融合位置决定了杂交的质粒是否表现聚集型或(和)高频转导。该项研究表明可能存在乳糖编码的转移因子以特定的方式编码生成不同表型的扩大质粒。

有学者通过在pLP712中引入两个缺失位点而形成一个23.7kb微小乳糖质粒，该质粒小分子结构更适合于分离和对插入DNA的分析。对大量的扩大的质粒进行限制酶分析发现，插入位点发生在pLP712限制酶图谱中一个3kb大小的固定位点，正如Anderson和McKay研究的一样，插入的DNA不同但表现了一定的相关性。已成功绘制乳酸链球菌(Str.lactis 712)中环状分子插入DNA的图谱，观察到插入的DNA具有一个相同的末端和一个不同的末端，从而决定了插入DNA分子大小的不同和插入系谱成员的不同。目前亟待解决的问题之一是新插入DNA片段来自哪里，有学者分析该片段可能是一个难以分离的质粒，也可能是一个位于细菌染色体上的转座转移因子或者两者都有［24］。

3.5 乳链球菌体内DNA重排

当一个给定的乳链球菌的DNA包含一个细菌染色体和一个补体质粒时，DNA在体内的排列过程会发生改变。乳酸链球菌(Str.lactis 712)的乳糖质粒缺失是非常容易发生的，在通过吖啶黄或升高温度处理、原生质体再生、重复培养传代、接合转移之后，通过转导可以被筛选出来。乳酸链球菌(Str.lactis 712、C2)和乳脂链球菌(Str.cremoris C3)乳糖质粒的乳糖和蛋白酶基因可以在转导后插入到到染色体中。在接合转移过程中有时可以通过插入新的DNA来构建扩大的乳糖质粒。有学者已成功将一个扩大的乳糖质粒的乳糖基因转移到了一个8.5kb的缺乏重组系统的Str.lactis ML3突变体隐蔽性质粒中［29］。在这些实验中发现可以将DNA插入到一个乳糖质粒的位点上来构建通过接合转移生成的扩大的乳糖质粒，所有从非携带质粒的乳酸链球菌(Str.lactis 712)菌株中筛选出来的Lac+Prt+质粒都具有相同的消除位点，95%通过原生质体融合生成的Lac+Prt-质粒消除位点也是相同的。由这些有序的分子学相互作用可以看出在乳链球菌的基因组中可能存在插入序列和转座子。Neve等人［15］发现细菌素质粒与多种隐蔽性质粒之间有较弱的杂交现象。

4 结论

乳酸菌遗传学将会应用到强化和创造新的发酵剂菌株当中，目前已经发现了两条质粒调控的噬菌体抗性、限制修饰和吸附阻塞机制。控制这些特性的基因被引用到不同的发酵剂菌株上，插入到已存在的发酵剂菌株质粒上或通过基因克隆分离后的质粒上，并可以由此获取一套对噬菌体侵染防御更强的发酵剂菌株防御系统。通过插入染色体的方法，已成功获取了乳酸链球菌(Str.lactis C2和712)中稳定的乳糖和蛋白水解酶，这有利于控制蛋白水解酶及它在奶酪成熟过程中发挥的作用，改善它在干酪制作过程中产生异味物质，并且还有可能控制基因的过表达。可以通过分离药物抗性菌株的方法进行改善奶酪中存留抗生素而导致发酵失败的现象。通过原生质体融合技术可以将抗冷冻基因转移到新的菌株中，从而增加直投式发酵的应用范围。基因克隆技术的发展使乳酸菌在工业领域的应用取得了更大的突破，如小牛皱胃酶，该基因已成功在大肠杆菌(E.coli)和酵母中克隆。

过去的10年间，乳制品乳酸菌已经在遗传工程和微生物群研究方面取得了重大的突破。在接下来的几十年中将会看到分子生物学技术在实践中的应用及遗传工程在乳酸菌中的应用，对近年来难以攻克的遗传现象将会有更加深入的理解。这些已经成熟的传统遗传学分析手段将会在不久的将来用于生产乳业工业中新型的发酵剂菌株，例如质粒转移会应用到生产噬菌体抗性更强或具有新的蛋白水解酶活性的菌株当中。遗传学研究的未来是被肯定的，我们已经进入到了乳业生物技术的时代中。

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