超声辅助酶解-索氏提取联用法提取马齿苋籽油及其脂肪酸组成分析*

2014-12-16刘璐萍谢翠品岳丽敬思群蔡远强童莲花

食品与发酵工业 2014年7期

刘璐萍，谢翠品，岳丽，敬思群，蔡远强，童莲花

1(新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐，830046)

2(新疆源森康乐生物科技有限公司，新疆乌鲁木齐，830013)

马齿苋(Portulaca oleracea L.)是国家卫生部认定的药食同源的野生植物之一［1-2］。马齿苋及其籽中含有丰富的多不饱和脂肪酸［3］。多不饱和脂肪酸具有抑制血栓形成、防止动脉硬化、保护心血管等作用［4-6］。目前关于马齿苋黄酮、生物碱、多糖等的研究较多［7-10］，但是对马齿苋籽油的研究鲜见报道，使得绝大多数马齿苋籽尚未开发利用。本研究以马齿苋籽油提取率为考察指标，优化马齿苋籽油的提取工艺并对其脂肪酸组成进行分析。

传统的植物油脂提取主要有压榨法、水蒸气蒸馏法、溶剂浸提法等，新型的方法有超声波辅助提取、生物酶法提取、超临界CO2萃取法等［11-12］。其中，超声波辅助提取法操作简单，提取温度低，提取率高;生物酶法不仅可以提高油脂质量，提高提油率，还可保持油料中组分不氧化，粕中蛋白不变性。尽管目前对超临界CO2萃取技术提取油的工艺研究较多，但由于设备、能耗等多因素的限制，在实际生产中的应用有限;而且目前大多数的研究都集中在油脂的提取工艺，对提油前原料预处理的研究较少，为此，本实验对马齿苋籽采用超声辅助酶解预处理得到最优预处理条件，再用传统索氏提取法进行油脂提取。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂及仪器

马齿苋籽，新疆源森康乐生物科技有限公司;复合酶(中性蛋白酶、纤维素酶)，杰诺生物酶有限公司;石油醚，天津市永晟精细化工有限公司;一氯化碘、KI、环己烷、冰乙酸、NaOH等均为AR级;去离子水，实验室自制。

HH-S型恒温水浴锅，巩义市英峪予华有限公司;RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂;DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司;KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 超声辅助酶解-索氏提取联用法提取马齿苋籽油工艺流程

马齿苋籽→粉碎→过筛(60目)→准确称量→加水混匀→调pH值→超声处理→加酶酶解→灭酶→冷冻→融解→烘干→滤纸包好装入索氏提取器→石油醚回流提取→ 旋转蒸发 →烘干→马齿苋籽毛油

1.2.2 操作要点

(1)粉碎、过筛:用微型万能粉碎机粉碎样品，粒度控制在60目左右，贮藏备用。

(2)调pH值:调节pH值到所用复合酶的最适pH值。

(3)超声处理:在超声功率40 W，超声温度55℃条件下，超声15 min。

(4)酶解:添加复合酶(中性蛋白酶∶纤维素酶=1∶1)，在一定添加量、温度、pH下酶解2 h。

(5)灭酶:将酶解后的样品在90℃下灭酶10 min。

(6)冷冻及融解:灭酶完成后，将酶解液置于超低温冰箱中于-30℃下放置30 min，之后在室温下融解。

(7)索氏提取:将已烘干的样品装入滤纸包并放入抽提筒中，加入1.67倍虹吸量的石油醚，调节水温在55℃，使冷凝滴下的石油醚连成珠状(回流7次/h以上)，抽提至抽取筒内的石油醚用滤纸点滴检查无油迹为止(约需6 h)。

⑧旋转蒸发:旋转蒸发后回收溶剂，在103～105℃烘干恒重后，计算出马齿苋籽油提取率。每组试验平行做3次，结果取平均值。

1.2.3 马齿苋籽油提取率的计算

式中:W，马齿苋籽油的提取率，%;m1，提取马齿苋籽油的质量，g;m2，称取马齿苋籽的质量，g。

1.2.4 超声辅助酶解-索氏提取联用法制备马齿苋籽油单因素试验

在液固比(mL∶g)为6∶1、pH 值7.0、酶解温度55℃的条件下，考察纤维素酶的添加量对马齿苋籽油提取率的影响;在 pH值7.0、纤维素酶的添加量为2%、酶解温度55℃的条件下，考察液固比对马齿苋籽油提取率的影响;在液固比(mL∶g)为5∶1、pH 值为7.0、纤维素酶的添加量为2%的条件下，考察酶解温度对马齿苋籽油提取率的影响;在液固比(mL∶g)为5∶1、纤维素酶的添加量为2%、酶解温度60℃的条件下，考察pH值对马齿苋籽油提取率的影响。

1.3 分析与测定

1.3.1 油脂的理化指标测定

过氧化值:参照文献测定［13］;酸价:参照文献测定［14］;碘价:参照文献测定［15］;皂化价:参照文献测定法［16］。

1.3.2 马齿苋籽油脂肪酸组成GC-MS分析［17］

1.3.2.1 马齿苋籽油甲酯化

采用KOH甲醇直接酯化法。分别称取2种方法获得的马齿苋籽油0.25 g，置于10 mL试管中，加入石油醚∶乙醚(体积比4∶3)溶剂5 mL，振荡溶解，再加入0.5 mol/L的KOH甲醇混匀溶液4 mL，振荡1 min，在室温下静置30 min后，再加入1 mL蒸馏水，使全部有机相甲酯溶液升至瓶颈上部，澄清后吸取上清液用于GC-MS分析。

1.3.2.2 GC-MS实验条件

GC条件:PEG-20M弹性石英毛细管柱，30 m×0.25 m×0.25 μm，载气为氦气，载气流速为0.8 mL/min，程序升温从180℃开始(保持2 min)，以3℃/min升温到230℃，保持10 min，进样口温度250℃，出样口温度200℃，检测电压350 V。

因为我从儿子在那边电话中的开心“哈哈”大笑声中，看到的是那身体已经长大且已娶妻生子、实则心理始终没有断奶的儿子的愚蠢、无知、不懂事和毫无责任感。因为他根本不知道、不关心、不理解母亲的真正快乐和幸福是什么，不是抚养了儿子又抚养孙子，照料了一个孙子又去照料第二个孙子，就是快乐和幸福。父母为子女辛劳、奉献了一生，理应有自己晚年的生活内容与精神追求，而抚养孙子、奉养父母则应属于做子女的责任和义务。可那儿子却全然不知这些，真让人可怜又可恨！

MS条件:EI离子源，电子能量70 eV，发射电流200 uA，扫描范围20～550 amu，全离子扫描。

按GB/T17377-2008进行测定，用峰面积归一化法确定了各组分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 水解马齿苋籽酶种类的确定

当液固比(mL∶g)为6∶1，中性蛋白酶、纤维素酶及复合酶分别在各自最适的pH、温度、相同的酶添加量/底物比条件下对马齿苋籽作用相同的时间，马齿苋籽油提取率见表1。

表1 不同酶的酶解条件和提取率Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of different enzymes and extraction rate

由表1可知，不经任何酶作用的对照组，马齿苋籽油的提取率较低，只有71.17%。加入不同酶，马齿苋籽油的提取率都得到明显提高。由此可见，利用蛋白酶对蛋白质进行水解，破坏蛋白质结构，从而有利于油脂通道的打开，使油脂被释放出来;利用纤维素酶降解植物细胞壁，使油脂容易游离出来，提高了马齿苋籽油提取率。但是由于酶的专一性，采用单一酶在酶解工艺中有很大局限性，因此，选择合适的复合酶，将会使细胞壁降解更彻底、效果更好。本实验选择纤维素酶与蛋白酶的复合酶，比单一酶的提油率有所提高，与传统索氏提取法相比提高了15.22%。

2.2 超声辅助酶解-索氏提取联用法提取马齿苋籽油的单因素试验

2.2.1 酶的添加量对马齿苋籽油提取率的影响

由图1可知，马齿苋籽油提取率随酶用量的增加而增大。复合酶添加越多马齿苋籽油提取率越高，其添加量达到2.0% 后，提高酶用量对提取率影响不大，当加酶量增加到2.5% 时，马齿苋籽油提取率增加缓慢。因此，选择酶的添加量为2.0%作为最适添加量。

图1 酶的添加量对马齿苋籽油提取率的影响Fig.1 Effects of the dosage of enzymes on extraction rate of seed oil

2.2.2 液固比对马齿苋籽油提取率的影响

图2 液固比对马齿苋籽油提取率的影响Fig.2 Effects of the liquid to soild ratio on extraction rate of seed oil

2.2.3 酶解温度对马齿苋籽油提取率的影响

从图3可知，在30～60℃内，马齿苋籽油的提取率随反应温度的升高而增大，60℃时达到最大，高于60℃后，马齿苋籽油的提取率呈下降的趋势。说明实验所用复合酶的最适温度为60℃，低于或高于此温度，将会影响酶反应效果。温度为60℃时，马齿苋籽油提取率最高，因此选定最适酶解温度为60℃。

图3 酶解温度对马齿苋籽油提取率的影响Fig.3 Effects of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate of seed oil

2.2.4 酶解pH对马齿苋籽油提取率的影响

从图4可知，马齿苋籽油的提取率随着酶解pH增大而增加，当pH值大于pH 5.0时提取率随着pH值的增加而减小，pH 5.0时，提取率达到了最大，因为酶解pH影响酶活力，适当的pH值通过静电作用，维持了酶活性中的最佳三维构象，促进酶与底物结合。所以最适pH值应为pH 5.0。

图4 酶解pH对马齿苋籽油提取率的影响Fig.4 Effects of enzymatic hydrolysis pH on extraction rate of seed oil

2.3 正交试验结果

在单因素试验的基础上，选取酶解pH、酶解温度以及液固比为试验因素，以马齿苋籽油提取率为实验指标，设置四因素三水平试验，选用L9(34)正交表进行试验(结果见表2和表3)。每个试验组合重复3次，结果取其平均值。用正交设计助手Ⅱv3.1.1统计软件进行结果分析。

由表2可知，影响马齿苋籽油提取率的因素顺序为:液固比＞酶解pH＞酶解温度。最优参数组合为A3B1C3D2，即液固比(mL∶g)6∶1，酶解温度 50℃，酶解pH 6.0。根据最佳组合条件进一步做验证试验，得出马齿苋籽油提取率为86.6%，与传统索氏提取法相比提高了15.43%。提取率符合正交试验中得到的结果，且结果重复性好，说明所选条件合理。由表3可知，超声辅助酶解预处理中酶解温度对马齿苋籽油提取率的影响最小。液固比和酶解pH对提取率的影响显著，酶解温度对提取率的影响不显著。

表2 正交试验结果表Table 2 Orthogonal experiments result

表3 对提取率的方差分析表Table 3 Variance analysis of the extraction rate

2.4 提油方法效果比较

2.4.1 两种方法制备油的理化性质比较

由表4可知，不同的方法对所提油脂的气味、滋味和色泽无显著影响，但超声辅助酶解-索氏提取联用法所得马齿苋籽油的酸价、过氧化值均低于索氏提取法，说明在超声辅助酶解预处理马齿苋籽的过程中可能降解了部分影响油脂品质的杂质，相对保护了马齿苋籽油的品质。

2.4.2 两种方法制备油的GC-MS结果比较

从表5可以看出，马齿苋籽油含有8种不饱和脂肪酸，占脂肪酸总量的85.98%左右。超声辅助酶解-索氏提取联用法所得马齿苋籽油的ω-3脂肪酸含量高达40.26%，其次为亚油酸 29.43%和油酸15.61%。2种方法制备的马齿苋籽油的脂肪酸成分基本一致，但超声辅助酶解-索氏提取联用法同索氏提取法相比，前有所得油的亚油酸含量略高，而油酸含量要略低，且马齿苋籽油提取率高。

表4 两种方法制备的马齿苋籽油的理化性质比较Table 4 Comparison of physical and chemical properties in seed oils obtained by two methods respectively

表5 两种方法制备的马齿苋籽油的脂肪酸组成比较Table 5 Comparison of the fatty acid composition in seed oils obtained by two methods respectively

3 结论

超声辅助酶解预处理马齿苋籽的最优条件为:复合酶添加量2%，液固比(mL∶g)6∶1，酶解温度50℃，酶解pH6.0，在索氏提取马齿苋籽油的最优工艺条件(55℃，6 h)下，马齿苋籽油提取率可达86.8%，与传统索氏提取法相比提高了15.43%。2种方法制备的马齿苋籽油的脂肪酸成分基本一致，但超声辅助酶解-索氏提取联用法所得马齿苋籽油的不饱和脂肪酸含量高于索氏提取法，且前者所提马齿苋籽油的酸价、过氧化值均低于后者所得马齿苋籽油。由此可知，超声辅助酶解-索氏提取联用法优于索氏提取法。

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