稳定同位素碳、氮在冬虫夏草原产地鉴别中的应用*

李辉，姚粟，刘洋，白飞荣，扎西·才吉，程池

1(中国食品发酵工业研究院中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京，100015)

2(玉树藏族自治州三江源药业有限公司，青海玉树，810003)

冬虫夏草(Ophicordyceps sinensis)是我国青藏高原地区的珍稀物种资源，富含虫草酸、虫草素、虫草多糖、麦角甾醇等多种生物活性物质，具有独特的保健功能和特殊药效［1］。不同来源的冬虫夏草由于受到当地土壤、气候以及其他生长环境因素的影响，在虫体的大小，饱满度以及有效成分的含量上存在较大差异，因而经济价值也不同。目前，市场上产于青海玉树、果洛，西藏那曲等地区的冬虫夏草由于虫体大而饱满，价格要高于其他产地的虫草，一些不法商家为谋取高额利润，常常以其他产地虫草冒充玉树、果洛或那曲虫草销售，严重损害了消费者利益，不利于冬虫夏草产业的健康有序发展。

目前，我国尚未建立稳定有效的冬虫夏草的原产地鉴别技术方法。长期以来，我国对冬虫夏草产地鉴别技术主要集中于冬虫夏草的形态学、理化指标的分析和检测方法等方面［2］，这类常规方法操作复杂，且检测指标尚不完善，在准确性和高效性方面存在一定的局限性。近年来，一些研究者陆续将随机扩增多态性DNA(RAPD)［3］、简单序列重复区间扩增多态性(ISSR)［4］等分子生物学技术应用于冬虫夏草产地鉴别，但是同一个产地冬虫夏草样品之间本身就存在着较大的遗传差异(主要在于冬虫夏草寄生的蝙蝠蛾幼虫种类不同)，这类通过分子遗传差异来鉴别冬虫夏草的技术很难产生重复性好，稳定性高的结果。因此，建立一套快速、准确的冬虫夏草原草原产地鉴别方法成为亟需解决的问题。

稳定同位素分析技术在过去30多年间，已在食品生产的某些领域，如葡萄酒、饮料、蜂蜜等［5-7］的产地鉴别中成功应用，有些同位素方法已得到官方分析化学家协会(AOAC)及欧洲标准化委员会(CEN)的认可［8］。近年来，其在中药材的地理来源溯源分析中也开始有应用的报道，如Micha Horacek等［9］利用C、N、H等稳定同位素对来源于中国和韩国的人参展开产地鉴别研究，对29种样品进行了准确的产地鉴别，并认为该技术是一种稳定有效的产地鉴别技术。

本课题组在前人研究的基础上，利用同位素比值质谱仪对不同产区冬虫夏草样品的N、C稳定同位素进行测定分析和比对研究，试图建立一种快速有效的冬虫夏草稳定同位素溯源技术方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 冬虫夏草样品

本研究收集了来自我国青海省、四川省、云南省以及尼泊尔的12个不同产区冬虫夏草样品，以及来自贵州省、江西省和湖南省的3种亚香棒虫草样品。

1.1.2 主要仪器

Delta v Advantage稳定同位素比值质谱仪、Flash EA1112元素分析仪、ConfloⅢ稀释仪，美国 Thermo Scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 冬虫夏草样品的前处理

取冬虫夏草样品一支，用去离子水浸泡清洗，在60℃恒温干燥12 h，用V(三氯甲烷)∶V(甲醇)=2∶1混合液浸泡2 h进行脱脂，用去离子水清洗、浸泡30 min，再用 V(三氯甲烷)∶V(甲醇)2∶1混合液浸泡。最后用去离子水清洗，60℃干燥后采用组织研磨仪研磨至粉末状，转移至1.5 mL离心管中保存。

1.2.2 稳定同位素的测定

分别取1.0 mg和0.5 mg前处理后的样品，用锡箔杯包好后通过自动采样器送到元素分析仪中，将样品中的氮元素转化成为N2和CO2气体，再经过稀释仪，最后进入质谱仪进行检测。具体参数如下:

元素分析仪:进样器氦气吹扫流量为200 mL/min，氧化炉温度为980℃，还原炉温度为650℃，载气氦气流量为90 mL/min。稀释仪:氦气稀释压力为60 kPa，N2和CO2参考气压力均为60 kPa。

1.2.3 数据处理和统计分析

同位素测定结果以 δ‰表示:δ‰ =(R样品/R标准-1)×1 000，R代表样品和标准物质中重同位素与轻同位素的丰度比，δ13C的标准物质为V-PDB，δ15N的相对标准物质为空气。

采用Origin8.0软件对样品的δ15N和δ13C数据进行分析，获得不同来源冬虫夏草和亚香棒虫草样品的箱线图，并采用双样品t检验法，检验来源于青海玉树、果洛冬虫夏草样品和其他地区冬虫夏草样品的显著性差异，以及冬虫夏草样品和亚香棒虫草样品的显著性差异。

2 结果与分析

2.1 冬虫夏草N稳定同位素比值分析

12种不同来源冬虫夏草样品和3种亚香棒虫草样品的δ15N值测定结果见表1。其中来源于青海样品的δ15N值范围为-0.220‰～2.195‰，来源云南样品的δ15N值范围为-0.965‰～-0.190‰，来源于四川样品的δ15N值范围为0.055‰～0.280‰，来源于尼泊尔样品的δ15N值为-3.106‰，亚香棒虫草样品的δ15N值范围为-5.755‰～-3.160‰。

通过比对发现，不同地区冬虫夏草的δ15N值波动范围不同，除来源于青海海南州样品(δ15N=-0.220‰)与云南省样品δ15N值有重叠外，其他样品均可按青海、四川、云南、尼泊尔等地理来源有效区分(图1)，其中来源于玉树和果洛的优质冬虫夏草样品与其他来源冬虫夏草样品的δ15N值波动范围明显不同，双样品t检验结果表明两类样品存在显著差异(P＜0.009)(图2);冬虫夏草样品与亚香棒虫草样品的δ15N值波动范围差异尤为明显，双样品t检验结果表明两类样品也存在显著差异(P＜0.000 6)(图3)。

图1 不同来源样品δ15N值的箱线图Fig.2 Box plot of δ15N values from different samples

图2 来源于玉树和果洛的冬虫夏草样品与其他来源冬虫夏草样品的δ15N值箱线图Fig.2 Box plot of δ15N values between samples from Yushu-Guoluo and other origins

图3 冬虫夏草样品与亚香棒虫草δ15N值的箱线图Fig.3 Box plot of δ15N values between Ophicordyceps sinensis and Cordyceps hawkesii

2.2 冬虫夏草C稳定同位素比值分析

12种不同来源冬虫夏草样品和3种亚香棒虫草样品的δ13C值测定结果见表1。其中来源于青海样品的δ13C值范围为-27.90‰～-25.95‰，来源云南样品的δ13C值范围为-27.01‰～-26.10‰，来源于四川样品的 δ13C值范围为 -27.6‰ ～-26.64‰，来源于尼泊尔样品的 δ13C值为-28.34‰，亚香棒虫草样品的 δ13C值范围为-28.23‰ ～ -27.42‰(表1)。

通过比对分析发现，不同地区冬虫夏草的δ13C值波动范围均较大重叠，无法有效区分，但冬虫夏草δ13C值(-27.90‰ ～-25.95‰)和亚香棒虫草(-28.23‰～-27.42‰)具有一定的差异(图4)。

表1 冬虫夏草样品及δ15N测定结果Table 1 Ophicordyceps sinensis samples and δ15N values

图4 不同来源样品的δ13C值箱线图Fig.4 Box plot of δ13C values from different samples

3 讨论

本研究利用同位素比值质谱仪(IRMS)测定了来自我国青海、云南、四川以及尼泊尔的12个不同产区冬虫夏草以及来自贵州省、江西省和湖南省的3种亚香棒虫草的δ15N和δ13C值，数据统计分析结果显示，不同地区冬虫夏草的δ15N值波动范围明显不同，除来源于青海海南州的1个样品外，其他样品均可按青海、四川、云南、尼泊尔等地理来源有效区分;其中来源于青海玉树、果洛的优质冬虫夏草样品与其他产地冬虫夏草样品存在显著差异(P＜0.009);冬虫夏草样品与亚香棒虫草样品之间的差异尤为显著(P＜0.000 6)。本研究是国内外首次将稳定同位素比值分析技术应用于冬虫夏草产地鉴别的科研工作。

冬虫夏草稳定同位素组成与产地的空气密度、气候、土壤和植被类型密切相关。冬虫夏草主要生长于我国青藏高原及周边地区海3 800～5 200 m的高寒草甸草皮层，生长环境十分特殊，其在生长成熟过程中不断与外界环境进行物质交换。从冬虫夏草侵染幼虫到菌丝长满幼虫虫体的整个过程中，虫草处于土壤下，其体内物质组成受当地土壤与植被影响较大，待虫草长出子座后与空气直接接触，又受到当地空气、雨水等其他气候因素的影响，冬虫夏草体内稳定同位素受这些因素影响而发生自然分馏效应，导致不同产地冬虫夏草体内同位素自然丰度的差异。

本研究中不同产地冬虫夏草样品的氮稳定同位素比值具有显著差异，原因就在于不同产区的空气、土壤和植被等与冬虫夏草进行氮元素交换的主要客体，以及影响氮元素交换效率的雨水、风等气候条件不同，引起不同来源的冬虫夏草体内自然分馏效应的差异。植被是对冬虫夏草碳稳定同位素比值影响最大的因素，冬虫夏草寄主以植被根茎为主食，植被的碳同位素可通过食物链传递给蝙蝠蛾幼虫，并在其体内代谢中进一步分馏，使其同位素组成有所变化［10］。冬虫夏草均生长于高寒草甸上，植被类型大体相同，因而碳稳定同位素比值差异不明显。但是，亚香棒虫草生长于低海拔地区，其植被明显不同于高海拔地区，这是其碳稳定同位素比值不同于冬虫夏草的主要原因。

本研究所建立的氮稳定同位素比值分析技术方法能快速有效鉴别冬虫夏草原产地，在冬虫夏草与其相似品的鉴别中也有潜在的应用前景。但是，还需要进一步广泛收集不同的虫草测试样品，获得丰富的研究数据，并建立相应的数据信息系统，为将该技术方法应用于冬虫夏草的原产地鉴别提供重要的参考依据。

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