9个柑橘品种不同组织中5-甲基四氢叶酸含量的比较*

郭丽琼，吴厚玖，窦华亭

1(西南大学柑橘研究所，重庆，400712)2(西南大学食品科学学院，重庆，400715)

叶酸属于水溶性VB的一种，是人体内红细胞发育成长不可缺少的因子之一。它能参与核苷酸的生物合成和氨基酸代谢，是维持生物体正常生命过程所必需的一类有机物［1］。叶酸具有预防肿瘤［2-4］、神经管畸形［5］、巨幼红细胞贫血［6］和心血管疾病［7］等功能。叶酸具有多种衍生物形式，其中5-甲基四氢叶酸及其多聚谷氨酸盐是叶酸在天然植物中存在的最主要形式。柑橘中含有丰富的叶酸资源，为了解柑橘不同品种、不同组织中的叶酸含量，本研究利用高效液相荧光检测法测定9个不同品种柑橘的5-甲基四氢叶酸含量，并进行了分析比较。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柑橘品种 采收时间 采收地点奥林达夏橙 2012年5月28日 重庆市忠县长叶橙 2013年1月11日哈姆林甜橙 2012年12月12日奉节脐橙 2012年12月27日早津温州蜜柑 2012年10月29日台湾椪柑 2013年1月11日梁平柚 2012年10月29日沙田柚 2012年12月12日尤力克柠檬 2012年10月29日重庆北碚歇马镇中国农业科images/BZ_135_562_2528_864_2528.png学院柑橘研究所

5-甲基四氢叶酸标准品，瑞士Schircks Laboratories公司;大鼠血清、鸡胰腺冻干粉，上海物竞化工科技有限公司;KH2PO4、抗坏血酸、H3PO4、醋酸钠，成都科龙化工试剂厂;甲醇、乙腈(均为色谱纯)，美国Sigma公司;2-巯基乙醇，天津市光复精细化工研究所;KOH，重庆北碚化学试剂厂;NaCl(分析纯)，重庆川东化工(集团)有限公司。

1.2 仪器与设备

Dionex's Ultimate 3000高效液相色谱仪、荧光检测器，戴安(上海)分析仪器有限公司;Venusil MP C18色谱柱，天津博纳艾杰尔科技有限公司;恒温水浴锅，江苏金坛市中大仪器厂;LDZX-50FBS型立式压力蒸汽灭菌器，上海深谙医疗器械厂;CQ250超声波清洗器，上海超声波仪器厂;IEC CL31R冷冻离心机，德国ThermoFisher公司;SAX固相萃取小柱，上海安谱科学仪器有限公司;2X-2真空泵，南京真空泵厂;0.22 μm滤膜，天津津腾实验设备有限公司;FE20 pH计，瑞士Mettler Toledo公司;FAZO04B电子分析天平，上海精科仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制

精确称取5-甲基四氢叶酸标准品2.0 mg于100 mL容量瓶中，用含1 g/100 mL抗坏血酸和体积分数(下同)0.1%2-巯基乙醇的0.1 mol/L KH2PO4溶液溶解并定容至刻度，即得20 μg/mL的标准储备液。精密量取适量标准储备液，用上述KH2PO4溶液依次配制成不同质量浓度梯度的系列标准溶液，测定各标准液的峰面积，并绘制标准曲线。

1.3.2 果实的采集

选取正常生长的植株，从试验树的东、西、南、北方位随机采集果实10个供试验分析。

1.3.3 果实常规品质指标的检测

(1)单果重:称重法。

(2)纵横经:游标卡尺测量法。

(3)可滴定酸:根据 GB 8210-1987［8］:指示剂法，用碱中和法测定可滴定酸表示的游离有机酸含量。将10个新鲜果实进行分部位处理，取混合后经匀浆处理的果肉样品进行分析检测，每个样品平行测定3次。其可滴定酸以100 g果肉中柠檬酸的克数计。

(4)可溶性固形物:将10个新鲜果实进行分部位处理，取混合后经匀浆处理的果肉样品利用手持测糖仪，在室温为20℃条件下进行测定，每个样品平行测定3次。

(5)水分含量的测定:将10个新鲜果实进行分部位处理并分别混合，利用直接干燥法测定其各部位的水分含量，每个样品平行测定3次。

1.3.4 HPLC样品处理

对样品进行分部位检测，将采集的10个新鲜果实洗净，分离出柑橘果肉、囊衣、果皮、种子4部分，取各部位样品适量分别进行混合，将果肉匀浆和果皮捣碎后分别装在自封袋中，加入液氮使其快速冻结后放入黑色塑料袋中存放于-20℃冰箱贮藏，样品存放不超过14 d。分析检测时常温解冻。

果肉处理［9］:准确称取果肉3 g左右于125 mL三角锥瓶中，加20 mL萃取液(0.05 mol/L磷酸缓冲液，pH 6.8，含1%抗坏血酸和0.1%2-巯基乙醇)，水解条件为沸水浴15 min，其间不断振荡以使其充分水解，立即冰水冷却后于4℃、12 000 r/m条件下离心30 min，取上清液3 mL加入叶酸轭合酶即大鼠血清0.5 mL后于37℃恒温培养箱中温育20 h，再次以4℃、15 000 r/m的条件下离心20 min，将上清液于SAX固相萃取小柱进行纯化后获得提取液［10-11］，0.22 μm孔径滤膜过滤，待测。

果皮、囊衣和种子的处理［9］:准确称取样品2～3 g于研钵中，加入液氮进行研磨，用25 mL萃取液将样品转移至125 mL三角锥瓶中，经振荡沸水浴、离心、加酶、温育、再次离心、纯化等条件下获得提取液，0.22 μm滤膜过滤，待测。

需要注意的是由于5-甲基四氢叶酸的不稳定性，故在试验过程中，需在暗光条件下，所有的器皿如三角锥瓶、容量瓶等最好用棕色的或将其用铝箔纸包裹以避光，同时适量的VC和2-巯基乙醇作为抗氧化剂添加到萃取液中以保护5-甲基四氢叶酸，防止其氧化分解［12］。

1.3.5 测定

1.3.5.1 色谱条件

色谱柱:Venusil MP C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:V(乙腈)∶V(0.05 mol/L KH2PO4(pH 3.0))=6∶94;流速1.0 mL/min;柱温23℃;进样量20 μL;激发波长290 nm;发射波长360 nm。

1.3.5.2 样品测定

每个样品平行2次，采用反相高效液相荧光检测法进行测定。

1.3.5.3 试验数据分析

试验数据用Excel和Statistix软件，分析各柑橘品种不同组织部位中5-甲基四氢叶酸含量。

2 结果与讨论

2.1 果实的品质分析

本试验选取了商品栽培的四大主要柑橘种即甜橙、宽皮桔、柚和柠檬为试材，以各自比较常见的品种作为试验对象。分析各品种样品的单果重、纵横径、水分、可溶性固形物、可滴定酸等指标，结果见表2～表4。甜橙的可溶性固形物较高，特别是长叶橙和奉节脐橙，其可溶性固形物达到12%以上。台湾椪柑的可溶性固形物也较高，为11.9%;而尤力克柠檬最低，只有8.3%。尤力克柠檬中可滴定酸含量最高，而柚类果实中，可滴定酸含量最低，只有0.19 g/100 g果肉。所采样品均在果实完全成熟后采摘，其品质指标都较好。

2.2 不同品种柑橘不同部位的5-甲基四氢叶酸的含量

试验对柑橘不同品种的不同组织中5-甲基四氢叶酸的含量进行分析，结果如表5所示。可以看出，本试验所测柑橘品种中，果实果肉中5-甲基四氢叶酸含量高的为甜橙类，其中哈姆林最高，为29.28 μg/100 g，奉节脐橙 27.77 μg/100 g，奥林达夏橙24.58 μg/100 g，长叶橙 23.31 μg/100 g。其次为柚类，沙田柚果肉中 5-甲基四氢叶酸的含量为23.45μg/100 g，与长叶橙和奥林达夏橙没有显著性差异，而梁平柚只有15.01 μg/100 g，与其余品种差异显著。宽皮橘类果实果肉5-甲基四氢叶酸的含量较低，早津温州蜜柑果肉中的5-甲基四氢叶酸含量为 15.58 μg/100 g，台湾椪柑中含量为 8.92 μg/100 g，与其他品种差异显著;尤力克柠檬果肉中的5-甲基四氢叶酸含量最低，只有4.1 μg/100 g，与其他品种差异显著。

表2 不同品种果实单果重和横纵径Table 2 The weight and diameter of citrus

表3 不同品种果实果汁可溶性固形物和可滴定酸含量的变化Table 3 The soluble solid and titratable acid in pulp of citrus fruits

柑橘果实囊衣中5-甲基四氢叶酸的含量普遍比果肉中的少，只有奥林达夏橙、沙田柚和早津温州蜜柑的囊衣中所含的5-甲基四氢叶酸与各自果肉的含量相差不大，都不超过1.0 μg/100 g，其余品种中，囊衣所含5-甲基四氢叶酸比果肉中低。在所测品种中，奥林达夏橙的囊衣中5-甲基四氢叶酸含量最高，为25.18 μg/100 g;最低的则为台湾椪柑，只有6.22 μg/100 g。通过显著性分析发现，长叶橙、奉节脐橙、早津温州蜜柑、梁平柚和尤力克柠檬的囊衣中所含的5-甲基四氢叶酸含量没有显著性差异，奥林达夏橙和沙田柚囊衣中含5-甲基四氢叶酸差异不大，其余品种间差异显著。

柑橘果实果皮中5-甲基四氢叶酸的含量相比于柑橘其他组织的含量低，奉节脐橙品种的果皮含20.52 μg/100 g，是本试验所测品种中含量最高的，而最低含量的为柠檬果皮，只含有7.30 μg/100 g。通过显著性分析发现，甜橙类果实果皮中，除了奉节脐橙外，其余3种果皮中5-甲基四氢叶酸的含量差异不显著;温州蜜柑和台湾椪柑果实果皮中差异不显著;梁平柚和沙田柚中的差异也不显著。

表4 不同品种果实不同部位水分含量Table 4 Moisture content in various tissues of citrus fruits

柑橘果实种子中5-甲基四氢叶酸的含量普遍比其他组织的高，这可能与种子中水分含量较低有关，只有沙田柚种子的含量较其果肉和囊衣的低，仅有14.42 μg/100 g。其余品种种子中5-甲基四氢叶酸的含量都比较高，其中奥林达夏橙种子中的含量最高，有49.64 μg/100 g。通过显著分析，哈姆林甜橙和尤力克柠檬种子中5-甲基四氢叶酸含量没有显著性差异，台湾椪柑和梁平柚之间没有显著性差异，其余各品种间种子中5-甲基四氢叶酸的含量具有显著性差异。

大多数品种中，不同组织5-甲基四氢叶酸含量趋势为种子＞果肉＞囊衣＞果皮，甜橙类果实中5-甲基四氢叶酸的含量较其他品种的高。

由于本试验所取试验原料均为成熟果实，尚未了解柑橘果实发育过程中各组织中5-甲基四氢叶酸的消长情况，对柑橘果实叶酸利用还需进一步积累资料。此外，从试验结果可以看出，不同品种的5-甲基四氢叶酸含量差异较大，其原因尚不清楚，需要进一步开展原料产地、栽培方式、气候条件、土壤条件等对果实中5-甲基四氢叶酸含量影响的研究，探讨柑橘类果实的5-甲基四氢叶酸与产地、气候、土壤以及种植方式之间的相互关系，可以为柑橘及相关产品的品种溯源和营养源开发等提供技术支撑。

3 小结

甜橙类果实果肉中含5-甲基四氢叶酸最高，尤以哈姆林甜橙最高，为29.28 μg/100 g;其次为柚类;柑类品种果实果肉5-甲基四氢叶酸的含量较低;不同组织5-甲基四氢叶酸含量的基本排序为种子＞果肉＞囊衣＞果皮。

表5 不同品种果实不同部位5-甲基四氢叶酸的含量Table 5 Content of 5-methyltetrahydrofolate in various tissues of citrus fruits

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