火麻仁浓缩蛋白制备工艺研究及蛋白组成测定

王广莉，周鸿翔，黄小焕，柳荫，陈龙

（贵州大学化学与化工学院，贵州贵阳 550025）

火麻仁是桑科植物大麻（Cannabis sativa L.）的干燥成熟种仁，是典型的药食同源作物，在中国作为药食同源已经有3000多年的历史[1]。火麻仁蛋白质主要含有麻仁球蛋白和麻仁白蛋白。其中65%为麻仁球蛋白，麻仁球蛋白能够促进消化，相对无磷，是细胞DNA骨架原料；另外35%为白蛋白。这两种植物蛋白具备人体所有必需氨基酸，且属于容易消化的全价蛋白质，与其他植物蛋白质相比含丰富的精氨酸和谷氨酸，同时，有含量比较高的胱氨酸、蛋氨酸和组氨酸。精氨酸和组氨酸对儿童生长发育及中老年人预防心血管疾病有很重要的作用。含硫氨基酸、蛋氨酸和半胱氨酸都是合成酶所必需的氨基酸。经临床试验证明，除了火麻仁油的通便作用外，也能促进通便，同时具有提高耐缺氧、改善贫血、降低胆固醇和降血压等功效，是一种十分优异的植物蛋白质新来源。火麻仁蛋白粉含有坚果香味，很受食用者欢迎，可加到焙烤食物、奶制品及饮料制品中，既可增加营养价值，又能起到保健、医疗等作用[2-3]。

本研究以火麻仁冷榨饼粕为原料，采用高速剪切法制备火麻仁蛋白，在单因素实验基础上，结合正交分析研究液料比、剪切速度和剪切时间对火麻仁蛋白质提取率影响及它们之间的交互作用，从而确定高速剪切法制备火麻仁蛋白的最佳工艺。同时选用传统的Osborne分级分离方法和高效液相色谱仪测定火麻仁浓缩蛋白中的氨基酸组成及含量，对火麻仁营养成分获得全面了解，为火麻仁蛋白在医药领域的应用打下了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

火麻仁冷榨饼粕：冷榨提取火麻仁油脂后所剩饼粕。

MB23/MB25快速水分测定仪：奥豪斯仪器（上海）有限公司；K9840凯氏自动定氮仪：济南海能仪器有限公司；HFJ-10内切式匀浆机：天津市恒奥科技发展有限公司；B-290实验室小型喷雾干燥机：瑞士Buchi公司。

1.2 方法

1.2.1 火麻仁蛋白质制备方法

火麻仁冷榨饼粕→去残油→粉碎→组织匀浆→过滤→喷雾干燥→火麻仁蛋白粉

称取一定量去残油粉碎后饼粕，按一定液料比加入去离子水，调节不同的剪切速度剪切一定时间，使用滤布过滤剪切好的蛋白溶液去除不溶性纤维素等杂质，弃滤渣，滤液进行喷雾干燥，得火麻仁浓缩蛋白粉，称量浓缩蛋白粉质量，计算提取率，并取少量浓缩蛋白粉使用凯氏定氮法测其纯度。

1.2.2 火麻仁蛋白质提取率计算方法

1.2.3 火麻仁蛋白质纯度的计算方法

式中：X为粗蛋白质的含量，%；V1为试样消耗盐酸标准溶液体积，mL；V0为空白消耗盐酸标准溶液体积，mL；c为盐酸标准溶液浓度，（mol/L）；V 为试样分解液总体积，mL；V′为试样分解液蒸馏用体积；m为试样质量。

2 结果与讨论

2.1 去残油后火麻仁饼粕基本组成分析

对去除残油后的火麻仁饼粕进行粗蛋白、粗脂肪、水分、灰分、还原糖、淀粉、粗纤维的测定，测定结果如表1所示。

表1 去残油后火麻仁饼粕基本组成Table 1 The composition of cake removed oil

由表1可知，去除残油后的火麻仁饼粕，其粗脂肪含量为2.60%，而其粗蛋白质含量为68.66%，水分含量7.60%，灰分10.50%，还原糖1.33%，淀粉5.57%，粗纤维3.74%，为了提高蛋白质的含量，可从去除粗纤维和淀粉及还原糖等碳水化合物以提高蛋白质的含量。

2.2 液料比对火麻仁蛋白质提取率和纯度的影响

剪切速度 15000 r/min，剪切时间8 min，以火麻仁蛋白质提取率及纯度为指标，分别采用液料比（mL/g）为10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1 进行实验，所得结果见图1。

图1 液料比比对火麻仁浓缩蛋白提取率及纯度的影响Fig.1 Effect of Solid-liquid ratio on cannabi seed protein concentrate extraction rate and purity

由图1可知，随着液料比的增大火麻仁浓缩蛋白提取率及纯度均逐渐增大，当液料比为20∶1（mL/g）时火麻仁浓缩蛋白纯度达到最大值84.42%，之后随着液料比的增大纯度呈下降趋势，到液料比25∶1（mL/g）时纯度降到80.00%。而提取率在20∶1（mL/g）至25∶1（mL/g）期间变化剧烈，在液料比 25 ∶1（mL/g）时达到最大值78.28%，考虑到液料比过大时，不但增加能耗，而且会因增加废水量而加大环境的污染，最终选择液料比 25 ∶1（mL/g）为最佳液料比。

2.3 剪切速度对火麻仁蛋白质提取率和纯度的影响

在液料比25∶1（mL/g）、剪切时间10 min条件下，以火麻仁蛋白质提取率及纯度为指标，分别采用剪切速度 5000、 10000、 15000、 20000、 25000r/min 进行实验，所得结果见图2。

图2 剪切速度对火麻仁浓缩蛋白提取率及纯度的影响Fig.2 Effect of Shear rate on cannabi seed protein concentrate extraction rate and purity

由图2可知，随着剪切速度的增大，火麻仁浓缩蛋白得率及纯度均逐渐增大，当剪切速度为 15000 r/min时达到最大值，之后随着剪切速度的增大，反而呈下降趋势，这是因为经过一定速率的剪切处理，火麻仁蛋白凝聚的蛋白质分子逐渐解缔并伸展，高速剪切作用使蛋白质大分子聚集体破碎为蛋白质分子[4]，同时增加了原先包埋在分子内部的疏水基团的暴露机会。但剪切速率过大，使蛋白质分子产生不可逆的裂解，破坏程度加大，导致分子表现直径减少[5]，由此选择 15000 r/min为最佳剪切速度。

2.4 剪切时间对火麻仁蛋白质提取率和纯度的影响

在液料比 25 ∶1（mL/g）、剪切时间 15000 r/min 条件下，以火麻仁蛋白质提取率及纯度为指标，分别采用剪切时间 4、8、12、16、20 min 进行实验，所得结果见图3。

由图3可知，随着剪切时间的延长，火麻仁浓缩蛋白得率及纯度均呈上升趋势，在4 min～12 min期间其上升效果明显，12 min后趋于平缓，这是因为随剪切时间的延长，蛋白质空间构象发生变化，埋藏在蛋白质内部的活性物质暴露出来，然而，剪切时间进一步延长，部分蛋白质的活性部位逐渐被破坏[4]，因而趋于平缓，综上最终选择12 min为最佳提取时间。

图3 剪切时间对火麻仁浓缩蛋白提取率及纯度的影响Fig.3 Effect of Shearing time on t cannabi seed protein concentrate extraction rate and purity

2.5 火麻仁蛋白质提取正交实验结果分析

根据单因素实验，选取液料比、剪切速度、剪切时间三因素，选择三水平，以提取率和纯度为指标，进行L9（34）正交试验。

表2 因素水平表L9（34）Table 2 Factors and levels of multiple factors experiments

表3 正交试验设计及结果Table 3 Orthogonal experiment design and statistics results

对提取率进行极差分析，结果如表4所示，对提取率的较优组合为A2B2C2。3种影响因素的极差值（R）液料比＞剪切速度＞剪切时间，表明高速剪切法制备火麻仁浓缩蛋白效果影响最大的是液料比，其次是剪切速度，剪切时间影响较小。方差分析结果（表5）表明液料比对火麻仁浓缩蛋白提取率影响显著（P＜0.05，F比＞＞F临界值），剪切速度对提取率影响达到显著水平（P＜0.05，F比＞F临界值），剪切时间（P＜0.05，F比＜F临界值）影响不显著。

表4 极差分析表（提取率）Table 4 Analysis of range of orthogonal experiments

表5 方差分析表（提取率）Table 5 Analysis of variance of orthogonal experiments with multi-enzymes

对纯度进行极差分析，结果如表6所示，对纯度的较优组合为A1B2C2。三种影响因素的极差值（R）液料比＞剪切速度＞剪切时间，表明高速剪切法制备火麻仁浓缩蛋白效果影响最大的是液料比，其次是剪切速度和剪切时间。方差分析结果（表7）表明液料比对火麻仁浓缩蛋白纯度影响打显著水平（P＜0.05，F比＞F临界值），剪切速度和剪切时间对纯度（P＜0.05，F比＜F临界值）影响不显著。

表6 极差分析表（纯度）Table 6 Analysis of range of orthogonal experiments

表7 方差分析表（纯度）Table 7 Analysis of variance of orthogonal experiments with multi-enzymes

选用综合平衡法分析，由上表可知，对于提取率来说，极差最大的是液料比，其次是剪切速度，剪切时间最小，最佳组合为A2B2C2；对纯度来说，液料比、剪切速度、剪切时间的极差相差不大，最优水平组合为A1B2C2，而液料比对应的提取率极差大于纯度极差，所以最终平衡选择A2，综合上述分析，得较优生产工艺条件为A2B2C2，与单因素结果吻合。

2.6 火麻仁蛋白质各蛋白组分分布

选用传统的Osborne分级分离方法，对火麻仁浓缩蛋白分级分离，分为水溶蛋白、盐溶蛋白、碱溶蛋白、醇溶蛋白、泡沫蛋白，残渣中剩余的蛋白为残渣蛋白，用考马斯亮蓝法测定分离后蛋白溶液相对含量，结果如表8所示。

表8 火麻仁蛋白各蛋白组分的组成比例Table 8 The protein contentof cannabis protein

由测定结果可知火麻仁主要含盐溶性蛋白和碱溶性蛋白，其中含量最高的是碱溶性蛋白38.38%，其次是盐溶性蛋白31.52%，其总量占总蛋白的70%。而水溶性蛋白、醇溶性蛋白和泡沫蛋白含量均较低较低，分别为为8.83%、3.51%和3.47%，这也是火麻仁蛋白在水中的溶解性不好的原因。

2.7 火麻仁蛋白质氨基酸组成

根据GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》，使用安捷伦1100型高效液相色谱仪测定火麻仁浓缩蛋白中的氨基酸组成及含量，测定图谱如图4所示。

图4 火麻仁浓缩蛋白氨基酸组成图谱Fig.4 The amino acid composition map of cannabis condensing protein

由表9可知，火麻仁浓缩蛋白质有高含量的精氨酸和谷氨酸，同时，有含量比较高的苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、天门冬氨酸和组氨酸。精氨酸和组氨酸，它们对儿童生长发育都有着重要的作用，精氨酸容易在血管产生NO，这对于中年人预防心血管疾病很有帮助。必需氨基酸含量十分丰富，其中缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、组氨酸的含量均高于FAO/WHO的小孩推荐值，亮氨酸和苏氨酸的含量稍微低于FAO/WHO的小孩推荐值，而大大高于FAO/WHO的成人推荐值；与推荐的氨基酸模式相比，除了色氨酸、赖氨酸、胱氨酸稍微缺乏之外，火麻仁浓缩蛋白含有丰富的必需氨基酸。

表9 火麻仁浓缩蛋白质氨基酸组成测定结果Table 9 The determination results of amino acid of cannabis condensing protein

3 结论

本研究对提油脱脂后的火麻仁饼粕采用高速匀浆机剪切，提高火麻仁蛋白在水溶液中的溶解性，通过建立液料比、剪切速度和剪切时间的单因素实验，并结合正交试验优化制备工艺，获得了高速剪切法制备火麻仁浓缩蛋白工艺条件为：液料比25∶1（mL/g），剪切速度 15000 r/min，剪切时间12 min，在此最佳工艺条件下所制备的火麻仁蛋白粉提取率为76.325%，纯度达82.308%，达到浓缩蛋白的指标（70%）。选用传统的osborne分级分离方法和高效液相色谱仪测定火麻仁浓缩蛋白中的氨基酸组成及含量，测定结果为火麻仁主要含盐溶性蛋白和碱溶性蛋白，其中含量最高的是碱溶蛋白38.38%，其次是盐溶蛋白31.52%，其总量占总蛋白的70%。而水溶性蛋白、醇溶性蛋白和泡沫蛋白含量均较低，分别为为8.83%、3.51%和3.47%。

[1]De Padua L S N,Bunyaprafatsara R H M J.Lemmens(Eds.).Medicial and Poisonous Plants[J].Plant Resources of South-East Asia,1999(1)：167-175

[2] 胡光.火麻仁球蛋白在制备改蒋贫血的功能食品中的应用：中国：CN200610048836.4[P].2006-11-22

[3] 华欲飞.醇法大豆浓缩蛋白的物理改性[D].无锡：无锡轻工学院,1993

[4]吴海文.花生浓缩蛋白的制备、凝胶形成机理及其应用研究[D].北京：中国农业科学院,2009